Определение содержания жира в молочных продуктах

Методы определения жира в молоке и молочных продуктах и необходимое оборудование

Содержание жира – один из основных показателей качества молока и молочных продуктов. Необходимо проводить анализ данного параметра, чтобы определить пищевую ценность продукта и исключить фальсификацию. Для контроля жира в молоке и молочных продуктах используют следующие методы: кислотный, оптический, гравиметрический, экспресс-метод ультразвукового анализа, экспресс-метод ИК-спектроскопии.

Кислотный метод определения жира

Сущность метода. Еще одно название данного метода – метод Гербера. Его особенность заключается в том, что жир выделяется в градуированную часть жиромера под действием концентрированной серной кислоты и изоамилового спирта с последующим центрифугированием.

Необходимое оборудование (за исключением реактивов и посуды): водяная баня, центрифуга.

Ход анализа. В два чистых и сухих жиромера (бутирометра) добавляют пипеткой по 10 см ³ серной кислоты, а затем по стенке вливают 10,77 см ³ молока. После этого добавляют 1 см ³  изоамилового спирта из автоматической пипетки. Необходимо следить, чтобы горло жиромера оставалось сухим. Уровень смеси должен быть установлен на 1-2 мм ниже горловины, поэтому допускается добавление дистиллированной воды. Жиромер закрывают пробкой и встряхивают до полного перемешивания содержимого. Затем жиромер помещают на 5 минут в водяную баню при температуре 65 ^оС (±2 ^оС). После водяной бани жиромеры устанавливают в центрифугу симметрично друг напротив друга и оставляют центрифугировать на 5 минут. Затем снова помещают в водяную баню при такой же температуре на 5 минут. После этого жиромеры достают из водяной бани и производят отсчет жира по шкале. С помощью резиновой пробки совмещают нижнюю границу столбика жира с целым делением шкалы жиромера. Верхней границей столбика считают нижний край вогнутого мениска. Каждое малое деление молочного жиромера соответствует 0,1%, а каждое большое – 1%.

Преимущества метода

1. Нет необходимости производить калибровку оборудования.
2. Относительно низкие затраты на анализ, как следствие, низкая стоимость анализа одной пробы.
3. Применение к молочным продуктам любого типа.

Недостатки метода

1. Использование концентрированной серной кислоты, что может вызвать химический ожог при несоблюдении мер безопасности.
2. Большое количество факторов, влияющих на точность результатов анализа (ошибки оператора, медленное вращение центрифуги, неправильно установленная температура в водяной бане).

Гравиметрический метод определения жира и экстракция по Сокслету

Сущность метода. Принцип анализа заключается в обработке пробы соляной кислотой, добавлении спирта и последующей экстракции жира из получившейся смеси диэтиловым и петролейным эфирами, выпаривании растворителей и взвешивании остатка.

Необходимое оборудование (за исключением реактивов и посуды): весы лабораторные 2-го класса точности, шкаф сушильный, центрифуга, экстрактор жира – для автоматизации процесса

Ход анализа. Для проведения анализа используются экстрактор или сосуд ля экстракции, а также реактивы: 25%-ый раствор аммиака, этиловый спирт, диэтиловый эфир, петролейный эфир. Подробно методика описана в ГОСТ 5867-90. Для автоматизации процесса используют автоматические экстракторы жира по Сокслету. Автоматические экстракторы жира позволяют не только анализировать сразу несколько проб, но и контролировать процесс и следить за нагревом.

Преимущества метода

1. Высокая точность анализа.
2. Высокая эффективность.
3. Подходит для продуктов любого типа.

Недостатки метода

1. Трудоемкость.
2. Низкая скорость проведения анализа.

Экспресс-метод ультразвукового анализа

Сущность метода. Метод основан на распространении ультразвуковых волн в жидкости. В зависимости от физико-химических свойств продукта, варьируется и скорость ультразвука.

Необходимое оборудование: ультразвуковой анализатор молока.

Ход анализа. Анализ производится в течение 2-3 минут с помощью ультразвуковых анализаторов молока. Проба молока помещается в анализатор, затем прибор выводит результаты исследования на экране. При этом прибор дает результаты сразу по нескольким параметрам в зависимости от калибровки (жиру, белку, СОМО, добавленной воде и т.д.).

Преимущества метода

1. Высокая скорость анализа.
2. Анализ сразу нескольких показателей.
3. Относительно низкая стоимость прибора.
4. Не используются химреактивы.
5. Простота анализа.

Недостатки метода

1. Подходит только для сырого и восстановленного молока, а также для сливок.
2. Необходим тщательный уход (промывка анализатора).
3. Необходимость производить периодическую поверку анализатора.

Экспресс-метод инфракрасной спектроскопии

Сущность метода. Метод ИК-спектроскопии основан на том, что анализатор просвечивает продукт, анализирует спектр образца и сопоставляет его со спектрами, находящимися в библиотеке прибора. После сопоставления анализатор выводит результаты исследования и демонстрирует состав продукта.

Необходимое оборудование: инфракрасный анализатор

Преимущества метода

1. Быстрый анализ продукции – от 40 секунд до 1 минуты.
2. Анализ продукта любого типа (жидкости, пасты, твердые вещества), что дает возможность анализа продукции на любом этапе производства.
3. Практически полное отсутствие пробоподготовки.
4. При анализе не используются реактивы.
5. Простота анализа.

Недостатки метода

1. Дороговизна оборудования.
2. Необходимость покупки кювет для анализа, если какой-либо продукт не входит в стандартный набор калибровок.
3. Метод не является гостированным.

Оптический (турбидиметрический) метод определения жира

Сущность метода. Принцип анализа заключается в фотометрическом измерении степени ослабления лучистого потока светорассеяния слоем жировых шариков молока или молочного напитка. Анализ осуществляется при помощи прибора ЦЖМ-1, который не внесен в Росреестр.

Необходимое оборудование (за исключением реактивов и посуды): прибор ЦЖМ-1, весы, водяная баня.

Ход анализа. Сначала необходимо провести подготовку к анализу в соответствии с ГОСТ 5867-90 – приготовить растворитель и произвести контроль градуировки прибора. Необходимо включить прибор заранее, за 1 час до начала работы. На отсчетном устройстве устанавливают показания от 0 до 0,05% и проводят контроль прибора на сходимость результатов. Для этого  четырежды измеряют массовую долю жира в пробах с низким и высоким содержанием жира. Расхождения для одной пробы не должны превышать 0,05%. Проба молока, нагретая до 40 ^оС (±2 ^оС), поступает в смеситель, где смешивается с растворителем, а затем гомогенизируется и подается в фотометрическую кювету. Излучение фотометрируется и производится расчет по шкале прибора.

Преимущества метода

1. Дешевизна анализа одной пробы.

Недостатки метода

1. Необходимость проведения подготовки к анализу (подготовка растворителя, контроль градуировки прибора).
2. Использование химреактивов.
3. Необходимость проведения регулярной поверки прибора.

Количественное определение свободных жирных кислот в молочных продуктах

1. Введение

Жир крупного рогатого скота имеет сложный состав жирных кислот с более чем 400 отдельными жирными кислотами [1, 2]. Однако только 15 или 16 жирных кислот присутствуют в молоке при концентрациях выше 1% [3, 4]. Преобладающие жирные кислоты имеют прямую цепь атомов углерода с четным числом атомов углерода и могут быть насыщенными или ненасыщенными [5]. Примерный состав жирных кислот жира коровьего, овечьего и козьего молока приведен в таблице 1.Доля жира в коровьем, овечьем и козьем молоке составляет ~ 3,8, 7,1 и 3,7% соответственно, а на состав жирных кислот молока коров, коз и овец, помимо прочего, влияют диета, стадия лактации и порода [6 ]. Следовательно, пропорции некоторых жирных кислот могут сильно отличаться.

Таблица 1.

Распределение основных жирных кислот в коровьем, овечьем и козьем молоке.

Источник: по материалам Markiewick-Keszykca et al. [6].

Животные жиры сложны и содержат короткоцепочечные жирные кислоты (SCFFA), которые являются водорастворимыми и легколетучими и не присутствуют в растительных жирах [3]. Растительный жир состоит в основном из нелетучих жирорастворимых жирных кислот. Основными жирными кислотами в молоке являются C _{16: 0} и C _{18: 1} , составляющие от ~ 22–35 до 20–30% от общих липидов, соответственно [3].Жирные кислоты присутствуют либо в свободном состоянии, как свободные жирные кислоты (FFA), либо эстерифицированы как связанные жирные кислоты (FA) на глицеридах. Точное определение как FFA, так и FA может быть незаменимым для законодательных целей и контроля качества, а также для целей исследований и разработок. В этой главе основное внимание уделяется газохроматографическому обнаружению FFA. СЖК важны, так как они влияют на качество, вкус, текстуру, питание и здоровье продукта. На вкус многих молочных продуктов прямо и косвенно влияет профиль свободных жирных кислот [2, 7].Это особенно характерно для ферментированных молочных продуктов, поскольку FFA вносит прямой вклад в виде летучих ароматических компонентов или косвенно через летучих продуктов метаболизма, окисления или термической обработки (например, альдегидов, кетонов, спиртов, лактонов и сложных эфиров). СЖК также могут влиять на текстуру и функциональность, поскольку они влияют на поверхностное натяжение и пенообразующую способность молока [8, 9], но также было показано, что некоторые СЖК, такие как конъюгированная линолевая кислота, оказывают благотворное влияние на здоровье и питание [6].

Методы экстракции жира должны учитывать различия в растворимости и летучести различных длин углеродных цепей ЖК, присутствующих в молочном жире. Следовательно, любой метод точного количественного определения FA должен быть эффективным при извлечении как водорастворимых SCFFA, так и органических растворимых FA, избегать использования стадий испарения для предотвращения потерь летучих SCFFA и удаления или нейтрализации любой воды, которая может присутствовать в пример. До сих пор наиболее распространенным подходом к количественному определению FFA в молочной промышленности и в исследованиях является газовая хроматография (ГХ) в сочетании с пламенно-ионизационным детектором (FID).ПИД используется потому, что он относительно дешев, прост / надежен, воспроизводим и широко доступен. В этой главе подробно обсуждаются преимущества и недостатки некоторых методов, используемых для извлечения и количественного определения FFA в молочных продуктах с помощью GC-FID.

2. Определение свободных жирных кислот в молочных продуктах

2.1. Экстракция липидов

Экстракция жира из образца широко используется. Однако, как упоминалось ранее, следует избегать стадий испарения, чтобы предотвратить потери летучих SCFFA.Использовались такие растворители, как хлороформ [10], подкисленный диэтиловый эфир [11], гексан / диэтиловый эфир [12] и диэтиловый эфир / гептан [13]. Высокий уровень извлечения (> 92%) FFA был достигнут с использованием этих органических растворителей для сыра, но они гораздо менее надежны при применении в молоке из-за натурального масла в водной эмульсии молока и природы мембраны шариков молочного жира (MFGM). [14]. Кроме того, процедуры экстракции, в которых используются высокие температуры, такие как кипячение с обратным холодильником или дистилляция, также подвержены повышенному риску потери летучих SCFFA (ов).Во многих процедурах безводный сульфат натрия добавляется для поглощения присутствующей влаги в попытке предотвратить потери водорастворимого SCFFA в последующем процессе экстракции растворителем. При использовании смесей растворителей извлечение SCFFA может уменьшаться при увеличении неполярного компонента растворителя [11]. Растворители, способные экстрагировать весь диапазон FFA (ов), будут также извлекать оставшуюся липидную часть образца, и в зависимости от области применения может быть необходимо или целесообразно выделить компонент FFA перед анализом.Был использован ряд различных методов, таких как колонки кремниевая кислота / гидроксид калия (КОН) [10, 15, 16], ионообменные смолы [17–19], колонки с дезактивированным оксидом алюминия [12, 13] и колонки для твердофазной экстракции аминопропила. [13, 20].

Из-за сильнощелочной природы колонок с кремниевой кислотой / КОН или ионообменных смол может происходить гидролиз глицеридов [21, 22], что приводит к завышению оценки содержания FFA. Ву и Линдсей [16] реализовали использование двух разных колонок: предварительную колонку для удаления молочной кислоты, за которой следует колонка кремниевая кислота-КОН для выделения свободных жирных кислот в сыре Чеддер, чтобы решить эту проблему.FFA (-ы) элюировали 2% -ной муравьиной кислотой в этиловом эфире. Needs et al. [17] описали другой метод выделения FFA из молока с использованием предварительно обработанной амберлитовой смолы. Липидный экстракт смешивали со смолой с последующим удалением растворителя и промывкой для выделения FFA. Deeth et al. [12] использовали колонки с дезактивированным оксидом алюминия для выделения FFA и сообщили о высоком извлечении C _{4: 0} –C _{18: 1} из молока, сыра и масла. Кислотная природа конечного экстракта (6% муравьиной кислоты в диизопропиловом эфире), как сообщается, оказывает пагубное влияние на производительность колонки, поскольку фаза колонки ухудшается, и это приводит к модификации процедуры с использованием более низкой концентрации муравьиной кислоты ( 3%) в диэтиловом эфире [13].Де Йонг и Бадингс [13], используя эталонную смесь, сравнили характеристики аминопропиловых колонок и дезактивированного оксида алюминия при выделении FFA (-ов) и сообщили о 96–101% извлечении аминопропиловых колонок по сравнению с 82–89% извлечением деактивированного оксида алюминия. Эта процедура была модификацией того, что использовали Калузный и др. [20], которые получили 101,4% извлечения FFA, выделенных из липидов, с использованием твердофазной экстракции с аминопропиловыми колонками.

2.2. Деривитизация

Чтобы анализировать аналит с помощью ГХ, он должен быть летучим.Для большинства липидов это не так, и для улетучивания жирных кислот широко используются методы химической дериватизации. Наиболее распространенный подход заключается в преобразовании ЖК в более летучую форму, такую ​​как метиловые эфиры жирных кислот, широко известные как FAME (ы). Таким образом, МЭЖК вводятся в колонку для ГХ в виде жидкости, улетучивающейся в газовую смесь при заданном потоке или давлении. Разделение происходит за счет различий во взаимодействии отдельного FAME с фазой колонки ГХ и использования градиента температуры в печи ГХ.Отделенный индивидуальный FAME переходит из столбца в FID, а затем определяется количественно. Подход FAME используется в текущем международном стандарте для анализа ЖК в молочном жире [23]. FFA (ы) можно превратить в FAME (ы) с использованием метанола в присутствии подходящего кислотного катализатора. Первая стадия - протонирование кислоты метанолом с образованием промежуточного продукта, который теряет протон с образованием FAME. Для доведения реакции до завершения требуется избыток метанола, поскольку это обратимая реакция.Также необходимо исключить воду из реакции, так как она является более сильным донором электронов, чем алифатические спирты, и будет ингибировать образование промежуточного соединения [24].

Было разработано несколько методов анализа FFA молочных продуктов, дериватизированных при комнатной температуре, без использования водных растворителей или стадий выпаривания. Кристоферсон и Гласс [25] описали использование 10% соляной кислоты (HCl) в метаноле в растворе молочного жира перед анализом методом ГХ. Luddy et al.[26] использовали трифторид бора (BF ₃ ) в метаноле для этерификации FFA в сливочном масле. Хотя эти методы полезны, определение FFA достигается путем получения производных FFA с глицеридами, что включает две разные стадии получения производных. Гидроксид тетраметиламмония (TMAH) давно используется в качестве реагента этерификации для FA (s) [27]. Робб и Вестбрук [28] определили, что реакция ТМАГ протекает быстро при комнатной температуре и что соли легко разлагаются в нагретом отверстии для ввода ГХ с образованием метиловых эфиров и триметиламина (ТМА).Полученные выходы составляли от 85 до 95%, и был сделан вывод, что эти переменные выходы делают метод пригодным только для качественных целей. Ограничением многих процедур метилирования является необходимость извлечения кислот из водного раствора перед этерификацией. Даунинг [29] исследовал получение солей тетраметиламмония в водном растворе с последующим анализом методом ГХ и обнаружил, что этот метод является количественным и воспроизводимым. Даунинг и Грин [30] использовали ТМАГ для этерификации полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) и обнаружили, что сильная щелочная природа раствора ТМАГ мешает процессу этерификации.Авторы преодолевают это, снижая pH (7,5–8,0) с помощью 5% раствора уксусной кислоты. Преимущество этого подхода состояло в том, что аммониевые соли FA (-ов) можно подвергнуть пиролизу с образованием чистых сложных эфиров внутри порта ввода ГХ, поскольку существующие методы в то время требовали омыления кислот перед добавлением этерифицирующих агентов. Эти методы описывают омыление смесей ЖК сильным основанием, таким как гидроксид натрия (NaOH) или КОН, с последующей этерификацией метанольной кислотой, такой как HCl, серной кислотой (H ₂ SO ₄ ) или BF ₃ до определить содержание FFA.Если связанная с глицеридом FA также требует определения, для образования метиловых эфиров можно использовать метанольное основание, такое как метоксид натрия (CH ₃ NaO). Поскольку гидроксиды четвертичного аммония по своей природе являются сильными основаниями, в метанольном растворе могут образовываться метиловые эфиры связанных глицеридом FA (-ов), а поскольку аммониевые соли FFA (-ов) разлагаются с образованием метиловых эфиров, TMAH считался более подходящим реагентом в анализе FAME. Другие гидроксиды четвертичного аммония также использовали в анализе FAME.McCreary et al. [31] использовали гидроксид триметил (a, a, a-трифтор-м-толил) аммония в метаноле для определения содержания ЖК в растительных маслах, приготовленных в бензоле. Они сравнили этот подход с более распространенным CH ₃ NaO и достигли сопоставимых результатов. Они также были способны одновременно переэтерифицировать глицериды с образованием аммониевых солей FFA, которые при впрыске во вход ГХ этерифицировались за одну стадию приготовления. Опять же, это обеспечивало значительное преимущество по сравнению с существующими процедурами, которые требовали получения производных и анализа СЖК и глицеридов отдельно.Позже Меткалфф и Ван [32] также использовали ТМАГ в метаноле в одностадийном процессе для различных смесей липидов в диэтиловом эфире. Это приводило к различным фазам, в которых переэтерифицированные сложные метиловые эфиры глицеридов (FA) содержались в органической фазе, а соли аммония FFA (-ов) находились в водной фазе. Удобно, чтобы каждая фаза подходила для прямой инъекции в ГХ для определения характеристик FFA или глицеридов (FA). Позднее этот подход был применен для количественного определения FFA в молоке и сыре [33–36].Мартинес-Кастро и др. [33] также исследовали эффект нейтрализации реакционной смеси перед анализом, который обычно рекомендуется для ГХ-анализа для защиты колонки и любых ПНЖК, которые могут присутствовать. Они обнаружили, что нейтрализация основного раствора TMAH приводит к потере SCFFA (ов) и увеличению стандартных отклонений в аналитических данных. Они объяснили это диссоциацией солей аммония при выбранном pH (7,5–8,0). Преимущество ТМАГ состоит в том, что при пиролизе он разлагается до ТМА и метанола [31], которые являются очень летучими и поэтому подходят для анализа методом ГХ.Однако сообщалось, что ТМА мешает определению пиков [34]. Этот подход имеет очевидные преимущества в том, что как FFA, так и триглицеридные компоненты могут быть проанализированы из образца за одну экстракцию; однако ограничение процедуры с использованием реакции TMAH было подчеркнуто Martínez-Castro et al. [33]. Эти авторы отметили, что некоторое количество ЖК из органического глицеридного слоя было обнаружено в водном слое FFA, что привело к завышению оценки содержания FFA в сыре. Чтобы преодолеть это, авторы разделили каждый слой и промыли подходящим растворителем перед анализом.Чаварри и др. [36] определили, что при большом соотношении триглицеридов к FFA (что имеет место в большинстве молочных продуктов) проблема с диссоциацией FFA становится еще более выраженной. Авторы пришли к выводу, что необходимо выделить FFA из смеси липидов перед использованием метода экстракции / этерификации TMAH, чтобы уменьшить эту ошибку.

2.3. Прямое добавление в колонку FFA

Выделение FFA на колонках для твердофазной аминопропиловой экстракции (SPE) с последующим анализом GC-FID широко используется для количественного определения FFA [37–41], поскольку процесс выделения можно автоматизировать для степень и относительно прост в исполнении.В целом, это удобная альтернатива дериватизации и, как уже упоминалось, была разработана Калузным и др. [20] и впоследствии улучшенные [13, 37]. Этот подход работает без необходимости дериватизации, поскольку FFA летучие и, следовательно, могут испаряться в нагретом отверстии для впрыска. Используется холодный впрыск в колонку, за которым следует запрограммированное изменение температуры инжектора, так как это позволяет увеличить разделение FFA (-ов) на основе их летучести внутри инжектора. Существуют также коммерчески доступные колонки со специфическими фазами свободных жирных кислот (FFAP), которые обеспечивают полное разделение FFA с длинами цепей от C _{2: 0} до C _{22: 0.} Однако кислые экстракты снижают производительность колонки, а высокое сродство FFA к фазе колонки может привести к необратимой адсорбции, образованию хвостов пиков, паразитным пикам или образованию двойных пиков [42, 43].

2.4. Сравнение методов прямого добавления FFA и TMAH FAME в колонку

Chavarri et al. [36] сравнили процедуру этерификации экстракции ТМАГ с хроматографической процедурой на колонке, описанной Де Йонгом и Бадингсом [13], где СЖК выделяли с использованием аминопропиловых колонок перед прямым вводом в ГХ-ПИД.Существенные расхождения между обоими методами были очевидны при анализе FFA в сыре Чеддер. Уровни FFA были намного выше при использовании метода прямого впрыска в колонку (4007 ppm), чем при использовании метода TMAH (1683 ppm). Как правило, уровни FFA в сыре Чеддер ниже 2000 частей на миллион, таким образом, существует значительная ошибка при использовании метода прямого впрыска в колонку. Впоследствии было показано, что более высокие уровни FFA являются следствием диссоциации глицеридов в слое FFA. Это можно исправить, выделив FFA из липидной смеси перед применением экстракции / этерификации TMAH.Mannion et al. [44] также сравнили и подтвердили оба метода. Они использовали идентичную технику экстракции жира и выделения FFA для обоих методов, используя процедуру диэтиловый эфир / гептан, описанную Де Йонгом и Бадингсом [13]. Кроме того, при исследовании аналитической устойчивости оценивались точность, прецизионность, пределы обнаружения (LOD) и пределы количественной оценки (LOQ). Был проанализирован широкий спектр образцов молочных продуктов для оценки пригодности метода для количественного определения FFA в молочных продуктах, которые имеют разные матрицы образцов, липидный состав и концентрацию FFA.Среди исследуемых продуктов были сыры (Чеддер, Бри и Блю Стилтон), сухое цельное молоко, детские смеси, молоко, йогурт, мороженое и сыры с модифицированными ферментами. Повторяемость выражалась в процентах (%) относительного стандартного отклонения (RSD). Извлечение оценивалось добавлением известного количества FFA в каждый образец с расчетами, основанными на извлечении FFA между образцами с добавлением и без добавления. Измеренные уровни FFA варьировались от 173 ppm в детской смеси до 126 615 ppm в сыре, модифицированном ферментами.Оба метода дали аналогичные результаты для каждого типа образцов, а повторяемость была превосходной (0,8–13,8% RSD), за исключением молока, мороженого и йогурта (до 46,2% RSD). Диэтиловый эфир / гептан использовался в качестве экстрагирующего растворителя для обоих методов и не подходит для надежной экстракции FFA, если MFGM остается неповрежденным. Это легко исправить, используя альтернативную экстракцию на основе этанола, как описано De Jong и Badings [13] или De Jong et al. [37]. Анализ FFA непосредственно в виде кислот с использованием метода прямого добавления в колонку привел к проблемам с деградацией колонки из-за кислотной природы экстракта FFA.Это привело к сдвигу пиков времени удерживания, расширению пиков и потере разрешения со временем. Также потребовались дополнительные шаги для предотвращения и мониторинга уноса из-за высокого сродства FFA к фазе колонки. Анализ FFA методом TMAH FAME также не прошел без проблем. Наиболее летучие SCFFA элюировались с пиком растворителя, который влиял на чувствительность, и образование артефактов периодически мешало количественному определению других SCFFA. В целом, прямой метод на колонке оказался наиболее чувствительным с уровнем детализации 0.7 ppm и LOQ 3 ppm и требовали меньшего количества пробоподготовки, так как FFA вводили непосредственно после выделения без необходимости дериватизации. Хотя метод TMAH FAME был менее чувствительным из двух методов (LOD 5 ppm; LOQ 20 ppm), он оказался гораздо более надежным методом, при котором целостность колонки не пострадала во время анализа и времени удерживания, а пиковая хроматография оставалась стабильный. Кроме того, авторы описали автоматизированную процедуру дервитизации, которая была значительно быстрее и использовала меньшие объемы растворителя, чем традиционные процедуры.

2,5. Дальнейшее развитие методов GC-FID

Использование спиртов с более высокой молекулярной массой можно рассматривать как альтернативу решению многих проблем, связанных с метиловыми эфирами, таких как совместное элюирование пиков растворителя с наиболее летучими FAME (ами) и образование артефактов. Исследования Parodi [45] продемонстрировали повышенное извлечение SCFFA (ов), когда бутиловая этерификация проводилась вместо метиловой этерификации. Parodi [45] оценил несколько различных методов метилирования, таких как использование BF ₃ в метаноле [46], CH ₃ NaO [47] и методы бутилирования с использованием H ₂ SO ₄ в бутаноле [48], ди- н-бутилкарбонат [49] и BF ₃ в бутаноле [45] для определения жирнокислотного состава масляного жира.Пароди [45] выразил данные как соотношение количеств каждого сложного эфира жирной кислоты по отношению к соответствующему сложному эфиру миристата и получил лучшее извлечение при использовании бутиловых эфиров по сравнению с методами метанола BF ₃ в метаноле или CH ₃ NaO. Parodi [50] использовал КОН в бутаноле для образования бутиловых эфиров и представлял собой модификацию методов, описанных Christopherson и Glass [25], а также Kim Ha и Lindsay [51], где они использовали BF ₃ в бутаноле для количественного определения FFA в молоке. и сыр.Таким образом, использование бутиловых эфиров может быть более подходящей альтернативой метиловым эфирам при анализе FFA в молочных продуктах.

В большинстве публикаций по определению FFA в молочных продуктах упоминаются давно установленные методы экстракции. Похоже, что в последние годы мало или совсем не было разработок или подтверждений. Были предприняты некоторые попытки улучшить и проверить существующие методы экстракции жира. Широко используемый метод экстракции Folch et al. [52] была модифицирована Фирлом и соавт.[53] для извлечения липидов из проб молока, которые впоследствии были преобразованы в метиловые эфиры с использованием гидроксида триметилсульфония (TMSH) и проанализированы с помощью GC-FID. Они подтвердили свой подход, добавив в образцы молока триглицериды, и сообщили о LOD, LOQ, точности и точности, что было особенно полезно. Однако количественное определение FFA в образцах молочных продуктов не проводилось. Reis et al. [54] описали новый метод с использованием термодесорбции для выделения ЖК из молока с использованием TMSH для преобразования триглицеридов в FAME (ы).Образцы реагента и молока просто смешивались во флаконе с автоматическим пробоотборником, и при инициировании работы прибора происходила реакция с подогревом (процесс, который они называли термохимолизом) с количественным определением FA с помощью масс-спектрометрии ГХ (МС). Они сравнили это с методом экстракции Роуза-Готлиба [55], где обычная переэтерификация с использованием КОН в метаноле дала сопоставимые результаты в отношении извлечения и воспроизводимости, за исключением C _{4: 0} . Эти авторы также сообщили об ограничениях при работе с сырым негомогенизированным молоком с плохой повторяемостью между анализами.Это было связано с тем, что объем молока, который был использован для анализа, не был репрезентативным для всей пробы молока. Оценка метода THM была основана на линейности, воспроизводимости в сравнении с обычным методом экстракции, определение FFA не было включено. Юрченко и др. [56] применили подтвержденный подход к определению ЖК в молозиве крупного рогатого скота. Они выполнили экстракцию и подготовку FAME (ов) в соответствии с процедурой AOAC [57], где к образцу добавляли метанольный раствор NaOH, а затем метанольный BF ₃ для образования FAME (ов).Затем их экстрагировали из образца путем разделения фаз с использованием гептана и насыщенного раствора хлорида натрия (NaCl). Сообщалось о линейности, точности, прецизионности, LOD и LOQ. Этот метод можно применять к молоку и другим образцам молочных продуктов; однако индивидуальное определение FFA (ов) не было включено, и были исследованы только FA с длиной углеродной цепи C _{8: 0} –C _{18: 0} .

Amer et al. [58] описали новый подход к количественному определению FFA в молоке с помощью GC-MS.Они использовали этилхлорформиат для образования этиловых эфиров в растворе с добавлением пиридина в качестве катализатора в хлороформе. Восстановление дейтерированных внутренних стандартов FA использовали для количественного определения каждой FFA. Авторы также проверили метод и сообщили о повторяемости, линейности, восстановлении, LOD и LOQ. Этот метод применялся к различным образцам коровьего молока: сырого, жирного (3,55%), полуобезжиренного (1,5%) и обезжиренного молока (0,1%). Стабильность метода оказалась превосходной с RSD <4% для всех FFA и извлечением> 99%.Некоторые из проблем, связанных с летучестью и растворимостью в воде SCFFA (ов), связанных с метиловыми эфирами, преодолеваются за счет использования этиловых эфиров. Кроме того, устранение требования предварительной экстракции перед добавлением дериватизирующего агента дает определенные преимущества. Однако этот метод, по-видимому, ограничен только водными образцами, но представляется гораздо более подходящей альтернативой многим существующим методам.

3. Заключение

Несмотря на важность определения свободных жирных кислот в молочных продуктах для исследований, законодательной деятельности, разработки процессов и контроля качества, разработка методов была очень незначительной.Кроме того, было сообщено мало информации о валидации, аналитической надежности, линейности, точности, LOD и LOQ. Недавние разработки по улучшению методов экстракции, в которых была проведена валидация и о которых сообщалось, являются положительным шагом вперед [44, 52, 54, 58]. Тем не менее, существуют возможности для дальнейшего развития, чтобы создать методы, которые могут быстро, точно и точно определять количество FFA в широком спектре молочных продуктов эффективным и надежным способом.

Одновременное определение консервантов в молочных продуктах с помощью ВЭЖХ и хемометрического анализа

Сыр и йогурт - это два типа питательных молочных продуктов, которые используются во всем мире. Основными консервантами в молочных продуктах являются бензоат натрия, сорбат калия и натамицин. Максимально допустимые уровни этих добавок в сыре и йогурте установлены в соответствии с национальными стандартами Ирана. В этом исследовании мы разработали метод обнаружения этих консервантов в молочных продуктах с помощью обращенно-фазовой хроматографии с УФ-детектированием при 220 нм одновременно.Этот метод был выполнен на колонке C ₁₈ с ацетатным буфером аммония () и ацетонитрилом (73: 27 об. / Об.) В качестве подвижной фазы. Методика проведена на 195 образцах 5 видов товарных сыров и йогуртов. Результаты продемонстрировали недостаточное разделение, где предел обнаружения (LOD) и предел количественного определения (LOQ) варьировались от 0,326 до 0,520 мг / кг и от 0,989 до 1,575 мг / кг в бензоате и сорбате, соответственно. Коэффициент корреляции каждой калибровочной кривой в большинстве случаев был выше 0.997. Все образцы содержали бензоат натрия в различных диапазонах. Натамицин и сорбат были обнаружены в значительном количестве образцов, в то время как, согласно национальному стандарту Ирана, только сорбат разрешено добавлять в плавленые сыры в качестве консерванта. Чтобы контролировать качество молочных продуктов, необходимо определение консервантов.

1. Введение

В настоящее время технологии консервирования играют важную роль в пищевой промышленности. Как правило, они используются для улучшения качества, увеличения срока службы продуктов и, таким образом, увеличения срока их хранения.Скорость порчи пищевых продуктов можно контролировать с помощью многих процедур, таких как подходящая упаковка для предотвращения доступного кислорода, стерилизация, пастеризация, обезвоживание (сушка), копчение, замораживание и пищевые добавки [1]. Одним из способов консервирования молочных продуктов является потребление добавок. По данным комиссии codex alimentarius, эти вещества добавляются в пищу для поддержания или улучшения качества питания [2]. В конце 1988 г. Европейское Сообщество приняло законы об использовании добавок в пищевых продуктах, потребляемых человеком [3].В связи с этим Институт стандартных и промышленных исследований Ирана (ISIRI) регламентировал ограничение потребления пищевых добавок, таких как консерванты.

Молочные продукты в качестве важного пищевого продукта рекомендуется употреблять в надлежащих количествах ежедневно. Безопасность молочных продуктов следует учитывать при наличии консервантов. Допустимая суточная доза (ДСП) представляет собой количество ежедневного потребления вещества без какого-либо риска даже на всю жизнь. Согласно ADI, максимально допустимый предел для пищевых добавок основан на мг / кг массы тела.Наиболее часто используемые консерванты в молочных продуктах, таких как сыр и йогурт, - это бензоат, сорбат и натамицин [4]. Эти соединения обычно используются для подавления различных типов микроорганизмов (например, бактерий, дрожжей и плесени).

Бензоат натрия (E211) известен как первый химический консервант, одобренный в пищевых продуктах Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA). Его растворимость больше, чем у других солей бензоата, таких как калий и кальций. В обширном обзоре Sieber et al.(1995) исследовали естественное присутствие бензойной кислоты во многих типах молочных продуктов [5]. Исследования показали, что на бензоат натрия влияет pH. Следовательно, увеличение pH среды снижает эффективность бензоата. Он активен в кислой среде против бактерий, дрожжей и грибков [6].

Сорбат калия (E202) получают из калиевой соли 2,4-гексадиеновой кислоты (сорбиновой кислоты). Карбоксильная группа и сопряженные двойные связи в структуре сорбата являются реактивными и могут оказывать сильное влияние на антимикробную активность, а также на качество и безопасность продукта [7].Он широко применяется в пищевой промышленности в качестве консерванта из-за высокой стабильности, растворимости и простоты использования. Комбинация сорбата и бензоата играет более эффективную роль, чем использование каждого из них в сыре Lonely, для предотвращения и задержки роста плесени вместе с пропионовой кислотой [8–11]. Натамицин (E 235) представляет собой тетраенполиеновый макролид и имеет амфотерную структуру, как и другие макролиды. Низкая растворимость в воде (примерно 40 мг / кг) является преимуществом натамицина. Плесень растет на поверхности сыра, особенно при обработке поверхности таких продуктов, как сыр, что является основным фактором, ограничивающим срок хранения.Таким образом, консервант остается на поверхности продукта там, где он требуется. Натамицин активен почти против всех дрожжевых и плесневых грибов, но не обладает бактерицидным действием [12–14].

Использование бензоата, сорбата и натамицина в молочных продуктах в качестве добавок запрещено в Иране; только сорбат разрешен для добавок в плавленые сыры с максимальным уровнем 1000 мг / кг. Следовательно, определение этих консервантов необходимо для контроля безопасности и качества молочных продуктов.

Существуют различные аналитические методы определения этих консервантов в сыре и йогурте, такие как тонкослойная хроматография, УФ-спектроскопия, высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и газовая хроматография (ГХ).ВЭЖХ - наиболее распространенный аналитический метод обнаружения и количественного определения этих консервантов. Следует разработать практический метод одновременной идентификации всех консервантов [15, 16].

Целью настоящего исследования является разработка эффективного, простого, действенного и быстрого метода RP-HPLC для обнаружения трех консервантов за один прогон. Для измерения трех консервантов из сырной и йогуртовой матрицы была выбрана простая процедура экстракции. Результат параметров метода проверки указывает на точность метода.Наконец, чтобы обеспечить эффективный контроль качества молочных продуктов, метод был протестирован на 195 образцах товарных сыров и йогуртов на иранских рынках.

2. Методы и материалы

2.1. Выборка

В этом исследовании 195 образцов коммерческих сыров и йогуртов 15 марок и 5 типов были приобретены в супермаркетах, расположенных в Тегеране. Образцы сыров были разделены на следующие категории: сливочные, плавленые, лабнех (иранский сыр), молочные и рассольные сыры, а также образцы йогуртов были классифицированы следующим образом: обычный йогурт и пробиотический и ароматизированный йогурт (фруктовый, овощной и процеженный йогурт) в соответствии с Национальный стандарт Ирана (ISIRI).

2.2. Химические вещества и реагенты

Деионизированная вода была приготовлена ​​с помощью системы Thermo Scientific Barnstead Easy pure II. Бензоат натрия и сорбат калия, использованные в этом исследовании, были получены от Merck (Дармштадт, Германия). Стандарт высокой чистоты натамицина был приобретен у Sigma-Aldrich (Висконсин, США). Структуры этих консервантов показаны на Рисунке 1.