Определение белка в моче


Качественное определение белка в моче

Главная › Каталог статей › Клинические исследования › Исследование мочи

В состав рабочего места по определению белка в моче входят следующие элементы:

  1. Пробирки химические, агглютинационные.
  2. Набор градуированных пипеток.
  3. Пипетки с узким оттянутым концом.
  4. Спиртовки или газовая горелка.
  5. Черная бумага.
  6. Ледяная уксусная кислота.
  7. Сульфосалициловая кислота.
  8. Концентрированная азотная кислота.
  9. Дистиллированная вода.

Методики определения белка в моче

Все методики, применяющиеся для качественного определения белка в моче, основаны на свертывании белка. Свертывание белка проявляется выраженным в разной степени помутнением (от опалесценции до большой мутности) или выпадением хлопьев.

Качественное определение белка в моче может быть проведено одним из следующих способов:

  1. кипячением с 10% раствором уксусной кислоты;
  2. реакцией с 20% раствором сульфосалициловой кислоты;
  3. реакцией с 50% раствором азотной кислоты (проба Геллера);
  4. реакцией с 1% раствором азотной кислоты в насыщенном растворе поваренной соли (видоизмененная проба Геллера по Ларионовой).

Перед качественным определением белка в моче проводят следующую подготовительную работу: 1. Мутную мочу фильтруют через бумажный фильтр. Если получить прозрачный фильтрат не удается, производят повторное фильтрование через тот же фильтр или же смешивают мочу с небольшим количеством инфузорной земли или талька, после чего ее фильтруют. 2. Если моча имеет щелочную реакцию, ее подкисляют 10% раствором уксусной кислоты до слабокислой реакции под контролем лакмусовой или универсальной индикаторной бумажки. 3. При малом содержании солей (светло-желтая или бледно-желтая моча с малым удельным весом) к каждой пробе добавляют несколько капель насыщенного раствора поваренной соли, так как недостаток солей обусловливает свертывание белка.

4. Степень помутнения наблюдают с помощью черного фона. В качестве фона используют черный картон или черную бумагу, применяемую в фотографии. Учет реакции на черном фоне позволяет выявить малейшую степень помутнения.

В отдельном штативе располагают пронумерованные пробирки. В них производят одну из описанных ниже реакций.

1. Проба кипячением с 10% раствором уксусной кислоты. Для постановки этой пробы необходим 10% раствор уксусной кислоты, который готовят следующим образом: 10 мл ледяной уксусной кислоты помещают в цилиндр и доливают дистиллированной водой до метки 100 мл.

Техника определения белка. В химическую пробирку помещают 10—12 мл отфильтрованной мочи слабокислой реакции. Затем верхнюю часть пробирки с мочой осторожно нагревают до кипения и добавляют в нее 8—10 капель 10% раствора уксусной кислоты. Пробирку с мочой рассматривают на черном фоне в проходящем свете. При наличии белка в моче появляется мутность разной степени (от опалесценции до большой мутности) или выпадают хлопья. Контролем служит нижняя часть пробирки, не подвергавшаяся нагреванию. Этой пробой обнаруживают количество белка, начиная с 0,015%о (%о — promille).

2. Реакция с 20% раствором сульфосалициловой кислоты. 20 % раствор сульфосалициловой кислоты готовят следующим образом: 20 г сульфосалициловой кислоты растворяют в 70-80 мл дистиллированной воды, переводят в цилиндр емкостью 100 мл и доливают дистиллированной водой до метки. Приготовленный реактив хранят в посуде из темного стекла.

Техника определения белка. В две пробирки одинакового диаметра помещают по 2—3 мл отфильтрованной мочи слабокислой реакции, в одну из пробирок к моче прибавляют 3—4 капли 20% раствора сульфосалициловой кислоты, другая пробирка служит контролем. При наличии белка в пробирке с реактивом появляется мутность или выпадают хлопья свернувшегося белка. В контрольной пробирке жидкость остается прозрачной. Сульфосалициловая кислота наряду с белком сыворотки осаждает альбумозы (пептиды), представляющие собой продукт распада белка. С целью уточнения причины помутнения мочи пробирку с мочой подогревают. Мутность, причиной образования которой оказались сывороточные белки, усиливается, мутность же, обусловленная присутствием альбумоз, исчезает. Эта проба имеет ту же чувствительность, что и предыдущая.

3. Реакция с 50 % раствором азотной кислоты (проба Геллера). 50% раствор азотной кислоты готовят следующим образом: к 50 мл азотной кислоты удельного веса 1,2-1,4 приливают 50 мл дистиллированной воды (разведение 1:1).

Техника определения белка. В узкую небольшую пробирку (тина агглютинационной) наливают 1 мл  50% азотной кислоты. В пипетку с узким оттянутым концом набирают 1 мл отфильтрованной исследуемой мочи, наслаивают на реактив и пробирку переводят в вертикальное положение. При наличии белка на границе жидкостей появляется белое кольцо. Время появления кольца, его свойства зависят от количества белка: если белка мало, то кольцо появляется не сразу, поэтому за его появлением следят в течение 2,5-3 минут. Минимальное количество белка, определяемое этим методом, 0,033°/оо. При меньшем содержании белка в моче кольцо не образуется. Учет результатов реакции производят на черном фоне в проходящем свете.

4.    Реакция с 1% раствором азотной кислоты на насыщенном растворе поваренной соли - видоизмененная проба Геллера (по Ларионовой). Для проведения пробы используют 1 % раствор азотной кислоты, приготовленный на насыщенном растворе поваренной соли (реактив Ларионовой). 35 г поваренной соли растворяют в 100 мл дистиллированной поды, раствор фильтруют, к 1 мл концентрированной азотной кислоты удельного веса 1,2-1,4 приливают 99 мл приготовленного насыщенного раствора поваренной соли.

Техника определения белка такая же, как и при реакции с 50% раствором азотной кислоты (проба Геллера), но вместо 1 мл 50% раствора азотной кислоты в пробирку наливают 1 мл реактива Ларионовой и на него наслаивают 1 мл мочи. Появление белого кольца на границе жидкостей указывает на наличие белка в исследуемой моче. Проба по Ларионовой так же чувствительна, как и проба Геллера.

5.    Колориметрическая (сухая) проба качественного определения белка. Колориметрическая (сухая) проба качественного определения белка в моче основана на воздействии, которое оказывает белок на цвет индикатора в буферном растворе.

Техника определения белка. Кусочек индикаторной бумаги, предназначенный для определения белка погружают в мочу на короткое время. Пробу считают положительной, если бумажка окрашивается в сине-зеленый цвет.

Количественное определение белка в моче

Количественное определение белка в моче основано на том, что при наслаивании мочи, содержащей белок, на 50% раствор азотной кислоты или реактив Ларионовой на границе двух жидкостей образуется белое кольцо, причем если четкое белое кольцо появляется к 3 минутам, то содержание белка равно 0,033%о или 33 мг в 1000 мл мочи. Появление кольца ранее 3 минут свидетельствует о большем содержании белка в моче. При количественном определении белка в моче выполняют следующие правила:

  1. Количественное определение белка производят только в тех порциях мочи, где он был обнаружен качественно.
  2. Определение производят с тщательно отфильтрованной мочой.
  3. Точно соблюдают технику наслаивания исследуемой мочи на 50% раствор азотной кислоты или реактив Ларионовой в соотношении реактива с мочой (1:1).
  4. Время появления кольца определяют по секундомеру: при окончательном расчете количества белка учитывают время наслаивания мочи на азотную кислоту, которое равно 15 секундам.
  5. Разведение мочи производят исходя из свойства кольца. При этом каждое последующее разведение мочи готовят из предыдущего.
  6. Определение колец производят на черном фоне.

Наиболее распространены два метода количественно¬го определения белка в моче: метод Робертса - Стольникова - Брандберга и метод С. Л. Эрлиха и А. Я. Альтгаузена.

  1. Метод Робертса-Стольникова-Брандберга. По этому способу количество белка в моче определяют путем разведения ее до тех пор, пока при очередном наслаивании мочи на 50% раствор азотной кислоты или реактив Ларионовой кольцо появится точно к 3 минутам. Расчет количества белка производят, умножая 0,033%о на степень разведения мочи. Полученный результат выражает количество белка в миллиграммах на 1000 мл мочи, т. е. в promille (%о).
  2.  Метод С. Л. Эрлиха и А. Я. Альтгаузена. В штатив помещают ряд агглютинационных пробирок, в которые предварительно наливают по 1 мл 50% раствора азотной кислоты или реактива Ларионовой. Исследуемую мочу берут отдельной чистой, сухой пипеткой с узким оттянутым концом и наслаивают на реактив, после чего включают секундомер. За временем появления кольца следят, располагая пробирку на черном фоне. При появлении кольца секундомер выключают.

При наслаивании мочи в зависимости от количества белка может появиться компактное, широкое или нитевидное кольцо. Компактное, широкое кольцо появляется тотчас же после наслаивания мочи на реактив. Нитевидное кольцо может появиться сразу, до истечения одной минуты, или в промежутке от одной до 4 минут.

При появлении нитевидного кольца в пределах от одной до 4 минут производить разведение мочи не нужно! Для вычисления количества белка в этом случае достачно использовать предложенную авторами таблицу-план (табл. 1).

Пример 1. При наслаивании мочи на реактив нитевидное кольцо образовалось через 2 минуты. Если бы кольцо образовалось к 3 минутам, то количество белка было было бы равно 0,033%о.

В данном же случае кольцо образовалось раньше. Соответственная поправка, согласно таблице-плану, для времени в 2 минуты равна 1+1/8. Это значит, что белка в данной порции мочи будет в 1+1/8 раза больше, чем 0,033°/оо, т. е. 0,033%о X(1+1/8) = 0,037°/оо.

При появлении нитевидного кольца до 1 минуты, т. е. через 40-60 секунд, производят одно разведение мочи в 1,5 раза (2 части мочи + 1 часть воды), а затем вновь наслаивают разведенную мочу на реактив и регистрируют появление кольца. При расчете результатов учитывают, что моча была разведена в 1,5 раза.

Пример 2. После наслаивания разведенной в 1,5 раза мочи нитевидное кольцо появилось к 2 минутам. Если бы кольцо появилось к 3 минутам, то белка было бы 0,033%. Соответственная поправка согласно таблице-плану, для времени в 2 минуты равна 1+1/8. Белка в моче содержится 0,033%оX1,5X(1+1/8) = 0,056%о.

Если нитевидное кольцо появляется сразу, мочу разводят в 2 раза (1 часть мочи + 1 часть воды). Разведенную мочу вновь наслаивают на реактив и отмечают появление кольца по истечении 1 минуты.

Пример 3. При наслаивании разведенной в 2 раза мочи на реактив нитевидное кольцо появилось через 1 минуту 15 секунд. Тогда количество белка в исследуемой моче по аналогии с прежними расчетами будет равно 0,033%оХ2Х(1+3/8) = 0,091%. В случае появления широкого кольца мочу разводят в 4 раза (1 часть мочи + 3 части воды).

При последующем наслаивании разведенной мочи нитевидное кольцо может образоваться как до, так и по истечении одной минуты. В таких случаях расчет количества белка производят по аналогии с предыдущими примерами, т. е. 0,033% о умножают на степень разведения и на соответственную поправку.

Пример 1. Кольцо после разведения мочи в 4 раза появилось сразу же. Мочу разводят в 2 раза. После наслаивания мочи, разведенной в 8 раз (4X2), нитевидное кольцо образовалось через 1,5 минуты. В таком случае количество белка равно 0,033%оХ8X1,25 = 0,33%о и т. д. При появлении компактного кольца мочу разводят в 8 раз (1 часть мочи+ 7 частей воды). При последующем наслаивании разведенной мочи на реактив может образоваться либо компактное, либо широкое, либо нитевидное кольцо.

Пример 2. При наслаивании мочи на азотную кислоту тотчас же образовалось компактное кольцо. Мочу разводят в 8 раз (1 часть мочи + 7 частей воды) и вновь производят ее наслаивание. При этом опять получилось компактное кольцо. Тогда мочу разводят еще в 8 раз (для этого в цилиндр или в пробирку берут 1 часть разведенной мочи и прибавляют к ней 7 частей воды). После очередного наслаивания разведенной мочи нитевидное кольцо образовалось сразу. Мочу разводят в 2 раза (1 часть мочи + 1 часть воды). После очередного наслаивания разведенной мочи нитевидное кольцо образовалось к 2 минутам. Расчет количества белка данной порции мочи производят так: 0,033,%оX8X8X2X(1+1/8) = 4,8%о.

Помимо таблицы-плана, имеется таблица с рассчитанными цифрами белка (табл. 2). Если моча не разведена, то количество белка отыскивают в графе «Цельная неразведенная моча». При разведении мочи в целое число раз (8,4,2) используют табл. 1. При разведении мочи в 1,5 раза используют табл. 2.

Техника пользования таблицей для определения содержания белка в моче

В соответствующих графах таблицы наводят время появления кольца и степень разведения мочи. Цифра, находящаяся в точке пересечения горизонтальной и вертикальной линий, проведенных от этих двух показателей, указывает на количество белка в исследуемой моче (%о).

Возможно, что при положительной качественной пробе на белок кольцо при наслаивании на 50% раствор азотной кислоты не образуется. Это значит, что в моче белка меньше 0,033%о. В таких случаях количество белка в бланке анализа обозначают термином «следы».

Если белок определен количественно, в бланке анализа мочи отмечают содержание белка в promille, например «белок — 0,66%о».

Помимо количественного определения белка в отдельной порции мочи, рассчитывают суточное его количество в граммах. С этой целью собирают суточную мочу, измеряют ее количество и определяют содержание белка в promille. Затем производят расчет. Например, суточное количество мочи равно 1800 мл, белок - 7°/оо. Значит, белка в суточном количестве мочи содержится: 1,8X7 = 12,6 г.

ginekolog.my1.ru

Белок в моче: методы определения

Патологическая протеинурия является одним из наиболее важных и постоянных признаков заболеваний почек и мочевых путей. Определение концентрации белка в моче является обязательным и важным элементом исследования мочи. Выявление и количественная оценка протеинурии важна не только в диагностике многих первичных и вторичных заболеваний почек, оценка изменения выраженности протеинурии в динамике несет информацию о течении патологического процесса, об эффективности проводимого лечения. Обнаружение белка в моче даже в следовых количествах должно настораживать в отношении возможного заболевания почек или мочевых путей и требует повторного анализа. Особо следует отметить бессмысленность исследования мочи и, в частности, определения белка мочи без соблюдения всех правил ее сбора.

Все методы определения белка в моче можно разделить на:

  • Качественные,

  • Полуколичественные,

  • Количественные.

Качественные методы

Все качественные пробы на белок в моче основаны на способности белков к денатурации под влиянием различных физических и химических факторов. При наличии белка в исследуемом образце мочи появляется либо помутнение, либо выпадение хлопьевидного осадка.

Условия определения белка в моче на основе реакции коагуляции:

  1. Моча должна иметь кислую реакцию. Мочу щелочной реакции подкисляют несколькими (2 - 3) каплями уксусной кислоты (5 – 10%).

  2. Моча должна быть прозрачной. Помутнение устраняется через бумажный фильтр. Если помутнение не исчезает, добавляют тальк или жженую магнезию (около 1 чайной ложки на 100 мл мочи), взбалтывают и фильтруют.

  3. Качественную пробу следует проводить в двух пробирках, одна из них – контрольная.

  4. Искать помутнение следует на черном фоне в проходящем свете.

К качественным методам определения белка в моче относятся:

  • кольцевая проба Геллера,

  • проба с 15 – 20% сульфосалициловой кислотой,

  • проба с кипячением, и другие.

Как показывают многочисленные исследования, ни один из большого числа известных методов качественного определения белка в моче не позволяет получать надежные и воспроизводимые результаты. Несмотря на это, в большинстве КДЛ в России эти методы широко используются в качестве скрининга – в моче с положительной качественной реакцией в дальнейшем проводят количественное определение белка. Из качественных реакций чаще используют пробу Геллера и пробу с сульфосалициловой кислотой, однако пробу с сульфосалициловой кислотой большей частью считают наиболее подходящей для выявления патологической протеинурии. Проба с кипячением в настоящее время практически не используется в связи с ее трудоемкостью и длительностью.

Полуколичественные методы

К полуколичественным методам относятся:

  • метод Брандберга-Робертса-Стольникова,

  • определение белка в моче с помощью диагностических тест-полосок.

В основе метода Брандберга-Робертса-Стольникова лежит кольцевая проба Геллера, поэтому при данном методе наблюдаются те же ошибки, что и при пробе Геллера.

В настоящее время для определения белка в моче все чаще используются диагностические полоски. Для полуколичественного определения белка в моче на полоске в качестве индикатора чаще всего используется краситель бромфеноловый синий в цитратном буфере. О содержании белка в моче судят по интенсивности сине-зеленой окраски, развивающейся после контакта реакционной зоны с мочой. Результат оценивается визуально или с помощью анализаторов мочи. Несмотря на большую популярность и очевидные преимущества методов сухой химии (простота, скорость выполнения анализа) данные методы анализа мочи в целом и определения белка в частности не лишены серьезных недостатков. Одним из них, приводящих к искажению диагностической информации, является большая чувствительность индикатора бромфенолового синего к альбумину по сравнению с другими белками. В связи с этим, тест-полоски в основном приспособлены к обнаружению селективной гломерулярной протеинурии, когда практически весь белок мочи представлен альбумином. При прогрессировании изменений и переходе селективной гломерулярной протеинурии в неселективную (появление в моче глобулинов) результаты определения белка оказываются заниженными по сравнению с истинными значениями. Данный факт не дает возможности использовать данный метод определения белка в моче для оценки состояния почек (гломерулярного фильтра) в динамике. При тубулярной протеинурии результаты определения белка также оказываются заниженными. Определение белка с помощью диагностических полосок не является надежным индикатором низких уровней протеинурии (большинство выпускаемых в настоящее время диагностических полосок не обладают способностью улавливать белок в моче в концентрации ниже, чем 0,15 г/л). Отрицательные результаты определения белка на полосках не исключают присутствия в моче глобулинов, гемоглобина, уромукоида, белка Бенс-Джонса и других парапротеинов.

Хлопья слизи с высоким содержанием гликопротеидов (например, при воспалительных процессах в мочевых путях, пиурии, бактериурии) могут оседать на индикаторной зоне полоски и приводить к ложноположительным результатам. Ложноположительные результаты могут также быть связаны с высокой концентрацией мочевины. Плохое освещение и нарушение цветоощущения может быть причиной неточного результата.

В связи с этим, использование диагностических полосок следует ограничить скринирующими процедурами, а результаты, полученные с их помощью, следует рассматривать лишь как ориентировочные.

studfiles.net

Методы определения белка в моче

Небольшое количество белка в суточной моче обнаруживается и у вполне здоровых лиц, однако такие небольшие концентрации не выявляют в разовых порциях используемыми в настоящее время методами. Приблизительно 70% белков мочи здорового человека приходится на долю уромукоида — белка, являющегося продуктом почечной ткани; таким образом, доля гломерулярного белка в моче здоровых людей является ничтожно малой и протеинурия в норме составляет 50—150 мг/сут, причем большинство белков мочи идентично сывороточным. Принято различать следующие формы протеинурии в зависимости от места возникновения: преренальную, связанную с усиленным распадом белка тканей, выраженным гемолизом; ренальную, обусловленную патологией почек, которая может быть разделена на клубочковую и канальцевую; постренальную, связанную с патологией мочевыводящих путей и чаще всего обусловленную воспалительной экссудацией.

В зависимости от длительности существования выделяют постоянную протеинурию, существующую в течение многих недель и даже лет, и преходящую, появляющуюся периодически, иногда даже при отсутствии патологии почек, например при лихорадке и выраженной интоксикации. Целесообразно различать вариабельность протеинурии: при суточной потере белка до 1 г — умеренную, от 1 до 3 г — среднюю и более 3 г — выраженную.

Обнаружение в моче белков с относительно большой молекулярной массой свидетельствует об отсутствии избирательности почечного фильтра и выраженном его поражении. В этих случаях говорят о низкой селективности протеинурии. Поэтому в настоящее время широкое распространение получило определение белковых фракций мочи. Наиболее точны методы электрофореза в крахмальном и полиакриламидном геле. По результатам, полученным этими методами, можно судить о селективности протеинурии. Большинство качественных и количественных методов определения белка в моче основаны на его коагуляции в объеме мочи или на границе сред (мочи и кислоты); если есть способ измерить интенсивность коагуляции, то проба становится количественной.

Унифицированная проба с сульфосалициловой кислотой:

Необходимый реактив:
20%-ный раствор сульфосалициловой кислоты.
Ход исследования:
В 2 пробирки наливают по 3 мл профильтрованной мочи. В опытную пробирку прибавляют 6—8 капель реактива. На темном фоне сравнивают контрольную пробирку с опытной. Помутнение в опытной пробирке указывает на наличие белка, пробу считают положительной. Если реакция мочи щелочная, то перед исследованием ее подкисляют 2—3 каплями 10%-ного раствора уксусной кислоты.

Унифицированный метод Брандберга—Робертса—Стольникова:

В основу метода положена кольцевая проба Геллера, заключающаяся в том, что на границе азотной кислоты и мочи при наличии белка происходит его коагуляция и появляется белое кольцо.
Необходимый реактив:
30%-ный раствор азотной кислоты (относительная плотность 1,2) или реактив Ларионовой. Приготовление реактива Ларионовой: 20—30 г хлорида натрия растворяют при нагревании в 100 мл дистиллированной воды, дают остыть, фильтруют. К 99 мл фильтрата приливают 1 мл концентрированной азотной кислоты.
Ход исследования:
В пробирку наливают 1—2 мл азотной кислоты (или реактива Ларионовой) и осторожно, по стенке пробирки, наслаивают такое же количество профильтрованной мочи. Появление тонкого белого кольца на границе двух жидкостей между 2 и 3-й минутой указывает на наличие белка в концентрации примерно 0,033 г/л. Если кольцо появляется раньше 2 мин после наслаивания, мочу следует развести водой и провести повторное наслаивание уже разведенной мочи. Степень разведения мочи подбирают в зависимости от вида кольца, т.е. его ширины, компактности и времени появления. При нитевидном кольце, появившемся ранее 2 мин, мочу разводят в 2 раза, при широком — в 4 раза, при компактном — в 8 раз и т.д. Концентрацию белка при этом вычисляют путем умножения 0,033 на степень разведения и выражают в граммах на 1 л (г/л). Иногда белое кольцо получается при наличии больших количеств уратов. В отличие от белкового кольца уратное появляется немного выше границы между двумя жидкостями и растворяется при легком нагревании.

Количественное определение белка в моче по помутнению, образующемуся при добавлении сульфосалициловой кислоты:

Принцип метода:
Интенсивность помутнения при коагуляции белка сульфосалициловой кислотой пропорциональна его концентрации.
Необходимые реактивы:
1. 3%-ный раствор сульфосалициловой кислоты. 2. 0,9%-ный раствор хлорида натрия. 3. Стандартный раствор альбумина — 1%-ный раствор (1 мл раствора, содержащий 10 мг альбумина): 1 г лиофилизированного альбумина (из человеческой или бычьей сыворотки) растворяют в небольшом количестве 0,9%-ного раствора хлорида натрия в колбе вместимостью 100 мл, а затем доводят до метки тем же раствором. Реактив стабилизируют прибавлением 1 мл 5%-ного раствора азида натрия (NaN3). При хранении в холодильнике реактив годен в течение 2 месяцев. Специальное оборудование — фотоэлектроколориметр.
Ход исследования:
В пробирку вносят 1,25 мл профильтрованной мочи, доливают до 5 мл 3%-ным раствором сульфосалициловой кислоты, перемешивают. Через 5 мин измеряют на фотоэлектроколориметре при длине волны 590—650 нм (оранжевый или красный светофильтр) против контроля в кювете длиной оптического пути 5 мм. Контролем служит пробирка, в которой к 1,25 мл профильтрованной мочи долили до 5 мл 0,9%-ный раствор хлорида натрия. Расчет ведут по калибровочному графику, для построения которого из стандартного раствора готовят разведения, как указано в таблице. Из каждого полученного раствора берут 1,25 мл и обрабатывают, как опытные пробы. Прямолинейная зависимость при построении калибровочного графика сохраняется до 1 г/л. При более высоких концентрациях пробу следует разводить и учитывать разведение при расчете. Ложноположительные результаты могут быть получены при наличии в моче контрастных веществ, содержащих органический йод. Поэтому тест нельзя использовать у лиц, принимающих препараты йода; ложноположительный результат может быть также обусловлен приемом сульфаниламидных препаратов, больших доз пенициллина и при высоких концентрациях в моче мочевой кислоты.

Биуретовый метод:

Принцип метода:
Пептидные связи белка с солями меди в щелочной с образуют комплекс фиолетового цвета. Белки предварительно осаждают трихлоруксусной кислотой.
Необходимые реактивы:
1. 10%-ный раствор трихлоруксусной кислоты. 2. 20%-ный раствор меди (CuSO4∙5h3O). 3. 3%-ный раствор NaOH.
Ход исследования:
К 5 мл мочи, взятой из суточного количества, прибавляют 3 мл раствора трихлоруксусной кислоты, центрифугируют до постоянного объема осадка. Надосадочную жидкость отсасывают пипеткой, осадок затем растворяют в 5 мл раствора NaОН. К раствору добавляют 0,25 мл CuSO4, смесь перемешивают и центрифугируют. Надосадочную жидкость фотометрируют при длине волны 540 нм в кювете с длиной оптического пути 10 мм против дистиллированной воды. Концентрацию белка рассчитывают по калибровочной кривой, при построении которой на оси ординат откладывают концентрацию белка (г/л), а на оси абсцисс — оптическую плотность в единицах экстинкции. По полученной концентрации рассчитывают суточную потерю белка с мочой.

С помощью индикаторной бумаги (полосок):

Белок может быть обнаружен с помощью индикаторной бумаги (полосок), которые выпускаются фирмами “Albuphan”, “Ames” (Англия), “Albustix”, “Boehringer” (Германия), “Comburtest” и др. Принцип основан на феномене так называемой протеиновой ошибки некоторых кислотно-щелочных индикаторов. Индикаторная часть бумаги пропитана тетрабромфеноловым синим и цитратным буфером. При увлажнении бумаги буфер растворяется и обеспечивает соответствующий рН для реакции индикатора. При 3,0—3,5 аминогруппы белков реагируют с индикатором и меняют его первоначально желтую окраску на зеленовато-синюю, после чего, сравнивая с цветной шкалой, можно ориентировочно оценить концентрацию белка в исследуемой моче. Основной предпосылкой правильной работы индикаторных полосок является обеспечение pH в диапазоне 3,0—3,5 для протекания реакции. Если бумага находится в контакте с исследуемой мочой дольше экспозиции, указанной в инструкции, то цитратный буфер в ней растворяется, и тогда индикатор реагирует на истинный рН мочи, т.е. дает ложноположительную реакцию. В связи с тем, что емкость буфера ограничена, то даже при соблюдении методических указаний в пробах слишком щелочной мочи (pH > 6,5) получаются ложноположительные результаты, а в пробах слишком кислой мочи (рН < 3,0) — ложноотрицательные. Число реагирующих аминогрупп в составе отдельных белков различно, поэтому альбумины реагируют в 2 раза интенсивнее, чем такое же количество γ-глобулинов (белок Бенс-Джонса, парапротеины), и гораздо интенсивнее, чем гликопротеиды. Однако при большом количестве слизи с высоким содержанием гликопротеидов (при воспалении мочевыводящих путей) оседающие на индикаторной полоске хлопья слизи могут давать ложноположительные результаты. Чувствительность отдельных производственных серий индикаторной бумаги, равно как и отдельных видов бумаги, выпускаемых одной и той же фирмой, может быть различной, поэтому к количественной оценке белка этим методом следует относиться осторожно. Определение суточной потери белков с мочой при помощи индикаторной бумаги невозможно. Таким образом, индикаторная бумага уступает химическим пробам, в первую очередь пробе с сульфосалициловой кислотой, хотя и дает возможность быстрого исследования серии образцов.

Обнаружение в моче белка Бенс-Джонса:

Белок Бенс-Джонса может выделяться с мочой при миеломной болезни, макроглобулинемии Вальденстрема. Исследование целесообразно проводить только при положительной пробе с сульфосалициловой кислотой. Индикаторная бумага для обнаружения белка Бенс-Джонса непригодна.
Принцип:
Основан на реакции термопреципитации. Методы, с помощью которых оценивают растворение белка Бенс-Джонса при температуре 100 °С или повторное осаждение при последующем охлаждении, ненадежны, так как далеко не все белковые тела Бенс-Джонса обладают соответствующими свойствами. Наиболее достоверно выявление этого парапротеина осаждением его при температуре 40—60 °С, но и в этих условиях осаждение может не произойти в слишком кислой (рН < 3,0—3,5) или слишком щелочной (pH > 6,5) моче, при низкой относительной плотности мочи и при низкой концентрации белка Бенс-Джонса.
Необходимый реактивы:
2 М ацетатный буфер рН 4,9.
Ход исследования:
Профильтрованную мочу в количестве 4 мл смешивают с 1 мл буфера и согревают в течение 15 мин на водяной бане при температуре 56 °С. При наличии белков Бенс-Джонса уже в течение 2 мин появляется выраженный осадок, при концентрации белка Бенс-Джонса менее 3 г/л проба может получиться отрицательной. На практике это встречается крайне редко, так как большей частью концентрация белка Бенс-Джонса в моче значительная. С полной достоверностью белок Бенс-Джонса может быть обнаружен иммуноэлектрофоретическим исследованием при использовании специфических сывороток против тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов.

Определение альбумоз (протеоз):

Альбумозы — это продукты расщепления белков, принцип определения которых основан на том, что они не сворачиваются при кипячении, но дают положительную биуретовую реакцию и высаливаются некоторыми солями, особенно сульфатом аммония и ацетатом цинка в кислой среде. Нормальная моча альбумоз не содержит. Следы могут быть в нормальной моче в случае примеси семенной жидкости. В патологии альбумозы могут встречаться в моче при лихорадочных состояниях, переливании крови и плазмы, рассасывании экссудатов и транссудатов, распаде опухолей.
Необходимые реактивы:
1. Насыщенный раствор хлорида натрия. 2. Концентрированный раствор едкого натра. 3. Слабый раствор сульфата меди (почти бесцветный).
Ход исследования:
К моче, подкисленной уксусной кислотой, прибавляют насыщенный раствор хлорида натрия (1/3 объема), кипятят и горячую жидкость фильтруют. Альбумозы проходят в фильтрат, в котором их присутствие определяют биуретовой реакцией. К фильтрату прибавляют 1/2 объема концентрированного раствора едкого натра и несколько капель слабого раствора сульфата меди. При положительной пробе получается красно-фиолетовое окрашивание.

При положительной пробе с сульфосалициловой кислотой мочу нагревают. Если муть исчезает и вновь появляется при охлаждении, это означает, что моча содержит альбумозы или белковое тело Бенс-Джонса.

medkarta.com

Сайт преподавателя МКЛИ Байбулатовой Светланы Андреевны - МКЛИ. Химическое исследование мочи.

Химическое исследование мочи включает в себя определение белка, глюкозы, ацетона и ацетоуксусной кислоты, желчных пигментов и уробилиноидов и некоторых других ингредиентов.

Важным условием химического исследования мочи, особенно определения белка, является ее прозрачность.

Прежде чем приступить к исследованию, необходимо провести центрифугирование мочи: 10,0 мл. мочи вносят в центрифужную пробирку. Пробирку ставят в центрифугу. Включают прибор на 10 минут соблюдая все необходимые правила безопасной работы с центрифугой. Необходимо помнить, что центрифуга включается тогда, когда в приборе находится только чётное количество центрифужных пробирок.

Белок

В моче здорового человека белок не выявляется, поскольку те методы, которые используются обычно в клинике (проба с сульфосалициловой кислотой и биуретовая реакция) не позволяют обнаружить небольшие количества низкомолекулярных сывороточных протеинов (около 10–50 мг в сутки), которые и в норме проникают через неповрежденный почечный барьер.

Для обнаружения белка в моче (протеинурии) используют качественные и количественные методы, большинство из которых основаны на его свертывании или осаждении специальными реактивами.

Проба с сульфосалициловой кислотой.

В 2 пробирки наливают по 3–4 мл профильтрованной мочи.

В опытную пробирку добавляют 6–8 капель 20% раствора сульфосалициловой кислоты.

На темном фоне в проходящем свете сравнивают обе пробирки.

При наличии белка в зависимости от его количества образуется помутнение или выпадают хлопья свернувшегося белка (рис.  1, а).

Результаты обозначают следующим образом: реакция слабоположительная (+), положительная (++), резко положительная (+++).

Проба с азотной кислотой (кольцевая проба Геллера). 

В пробирку наливают 1–2 мл 30% азотной кислоты или реактива Ларионовой (1% раствор азотной кислоты в насыщенном растворе натрия хлорида) и осторожно по стенке наслаивают сверху такое же количество мочи.

При наличии белка через 2–3 мин (или раньше) на границе двух сред (кислоты и мочи) образуется тонкое белое кольцо свернувшегося белка (рис. 1, б).

Проба становится положительной даже при минимальной концентрации белка в моче — 0,033 г/л (0,033о/оо).

Следует, правда, помнить, что беловатое или красновато-фиолетовое кольцо при проведении этой пробы, располагающееся несколько выше границы между двумя жидкостями, может образовываться при наличии в моче большого количества уратов.

Однако уратное кольцо в отличие от белкового при легком нагревании растворяется.

Рисунок 1.

Схема качественного определения белка в моче с помощью проб с сульфасалициловой кислотой (а) и азотной кислотой (б).

На рис. 1, б стрелкой показано белое кольцо преципитации белка

Метод разведения Брандберга-Робертса-Стольникова 

Метод основан на количественной оценке результатов пробы с азотной кислотой (кольцевой пробы Геллера — см. выше).

Ход определения белка такой же, как и при этой качественной реакции.

Считается, что появление тонкого белого кольца на границе азотной кислоты и мочи (рис. 1, б) на 2–3-й минуте указывает на наличие белка в моче в концентрации 0,033 г/л.

Если кольцо появляется раньше 2 мин, мочу разводят в 2 раза и снова повторяют исследование.

Если и на этот раз кольцо появляется раньше 2 мин, мочу снова разводят в 2, 4, 8 и т. д. раз, пока тонкое белое кольцо не появится на 2–3-й минуте.

Искомую концентрацию белка в моче вычисяют, умножая 0,033 г/л на степень разведения.

Нефелометрический метод 

Метод основан на возникновении помутнения мочи при коагуляции белка сульфосалициловой кислотой.

Интенсивность помутнения пропорциональна концентрации белка.

В градуированную пробирку вносят 1,25 мл профильтрованной мочи, добавляют до 5 мл 3% раствор сульфосалициловой кислоты и перемешивают.

Через 5 минут измеряют на фотоэлектроколориметре при длине волны 590–650 нм против контроля в кювете с толщиной слоя 0,5 см.

Биуретовый метод 

Метод основан на свойстве белка давать с сернокислой медью и едкой щелочью так называемый биуретовый комплекс фиолетового цвета.

Интенсивность окраски, количественно определяемая на фотоэлектроколориметре, пропорциональна концентрации белка.

Определение суточной протеинурии. 

При заболеваниях почек, сопровождающихся протеинурией, уровень выделения белка с мочой в течение суток колеблется в широких пределах.

Поэтому в клинической практике выраженность протеинурии принято оценивать по суточной потере белка с мочой (суточной протеинурии).

В 8 ч утра пациент мочится в унитаз, после чего всю выделенную в течение суток (до 8 ч следующего дня) мочу собирают в отдельную емкость объемом 3 литра.

Затем измеряют общее количество мочи, тщательно размешивают ее и наливают в отдельную банку емкостью 150–200 мл.

В этой порции мочи определяют концентрацию белка по одному из методов, описанных выше.

Суточную протеинурию (в граммах) рассчитывают по формуле:

Pc=PxV,

где Рс — суточная протеинурия (в граммах); Р — концентрация белка в суточной моче (г/л); V — суточный диурез.

У здорового человека в разовой порции мочи при использовании перечисленных выше методов белок не определяется.

Выделение белка с мочой (протеинурия) имеет важное диагностическое значение.

Даже следы белка (0,033 г/л), обнаруженные в разовой порции мочи, требуют уточнения причин протеинурии.

Различают:

1. преренальную протеинурию, обусловленную усилением распада белка тканей (опухоли, ожоги, массивный гемолиз эритроцитов и т. п.);

2. ренальную протеинурию, связанную с патологией почек;

3. постренальную протеинурию, вызванную патологией мочевыводящих путей, и чаще всего связанную с воспалительной экссудацией (заболевания мочевого пузыря, мочеиспускательного канала, половых органов).

В практическом отношении важно отличать ренальную и постренальную формы протеинурии.

Постренальная форма протеинурии сопровождается появлением в моче большого количества лейкоцитов или эритроцитов.

При ренальной форме протеинурии в моче обычно присутствуют цилиндры.

Почечная (ренальная) протеинурия обусловлена повышением проницаемости клубочкового фильтра и уменьшением реабсорбции профильтровавшегося белка в почечных канальцах.

Различают функциональную (физиологическую, доброкачественную) и патологическую (органическую) почечную протеинурию.

Функциональная почечная протеинурия

Функциональная почечная протеинурия обусловлена временным преходящим увеличением фильтрации белков сыворотки крови в ответ на сильные внешние раздражения (необычные статические и динамические нагрузки, повышенная мышечная работа, лихорадка, интоксикация) и не связана с поражением почек и мочевыводящих путей.

Функциональная протеинурия вызвана замедлением почечного кровообращения или преходящим нарушением проницаемости клубочковых капилляров в результате вторичного токсико-инфекционного поражения (О. Шюк).

Следует помнить о нескольких наиболее распространенных вариантах функциональной почечной протеинурии:

1. Ортостатическая (юношеская) протеинурия выявляется у здоровых молодых лиц астенического телосложения с лордозом поясничного отдела позвоночника.

Она появляется при длительном нахождении в вертикальном положении и исчезает в горизонтальном положении.

2. Рабочая (маршевая) протеинурия, появляющаяся после тяжелой физической нагрузки.

3. Лихорадочная протеинурия, возникающая при различных заболеваниях, сопровождающихся повышением температуры тела.

Такая протеинурия исчезает после нормализации температуры.

4. Алиментарная протеинурия (после обильной белковой пищи).

5. Пальпаторная протеинурия (после продолжительной пальпации почек).

6. Эмоциональная протеинурия — при значительном психоэмоциональном напряжении.

Функциональная почечная протеинурия, как правило, не превышает 1,0 г/л и исчезает после устранения причин, ее вызвавших.

Во всех случаях обнаружения белка в моче необходимо тщательное обследование больного для исключения органических заболеваний почек, сопровождающихся патологической протеинурией.

Патологическая почечная протеинурия является одним из наиболее важных признаков органического поражения клубочкового аппарата и почечных канальцев.

Наиболее частыми причинами патологической почечной протеинурии являются:

1. острый и хронический гломерулонефрит;

2. острый и хронический пиелонефрит;

3. нефропатия беременных;

4. застойная недостаточность крвообращения;

5. амилоидоз почек;

6. туберкулез почек;

7. гипертоническая болезнь;

8. системные заболевания соединительной ткани с поражением почек;

9. геморрагический васкулит;

10. выраженная анемия;

11. анафилактический шок и другие причины.

Особенно значительной протеинурия бывает при нефротическом синдроме.

При нефротическом синдроме концентрация белка в моче достигает 3–10 г/л.

У больных с заболеваниями почек протеинурия усиливается при:

1) выполнении физической нагрузки;

2) длительном нахождении в вертикальном положении;

3) охлаждении тела.

Селективность протеинурии — это способность клубочкового фильтра пропускать молекулы белка плазмы в зависимости от его молекулярной массы.

При умеренном повреждении фильтрующей мембраны в моче преобладают низкомолекулярные белки (альбумины), тогда как белки с большой молекулярной массой (глобулины и др.) составляют небольшое количество. В этих случаях говорят о высокой селективности (избирательности) протеинурии.

Наоборот, при тяжелых поражениях почек селективность протеинурии снижается, и в моче появляются крупномолекулярные белки (например g-глобулины. В этих случаях качественный состав белков мочи приближается к белковому составу плазмы.

Таким образом, низкая селективность протеинурии свидетельствует о более тяжелом поражении клубочковых капилляров.

Глюкоза

В моче здорового человека глюкоза отсутствует, за исключением тех редких случаев, когда преходящая, кратковременная и незначительная глюкозурия вызвана избыточным употреблением в пищу простых углеводов или внутривенным введением концентрированного раствора глюкозы.

Во всех остальных случаях глюкозурию следует расценивать как явление патологическое.

Патологическая глюкозурия может быть обусловлена:

1. превышением определенного критического уровня глюкозы в крови (примерно 8,8–9,9 ммоль/л) в связи с ограниченной способностью канальцев почек реабсорбировать глюкозу;

2. увеличением фильтрации глюкозы в клубочках почек вследствие их повреждения;

3. снижением реабсорбции глюкозы в проксимальных отделах почечных канальцев за счет первичного или вторичного их повреждения.

Запомните!

Глюкозурия может выявляться как при повышенном, так и при нормальном уровне глюкозы в крови.

Существуют качественные и количественные способы выявления (определения) глюкозы в моче.

Проба Гайнеса основана на способности глюкозы при нагревании в щелочной среде восстанавливать гидрат окиси меди (синего цвета) в гидрат закиси меди (желтого цвета) и закись меди (красного цвета).

Для проведения реакции в пробирку наливают 4 мл реактива Гайнеса (смесь растворов сернокислой меди, едкого натра и глицерина), добавляют к нему 8–12 капель мочи и нагревают верхнюю часть пробирки на пламени горелки до кипения (нижняя часть пробирки служит своеобразным контролем) (рис. 2).

При наличии в моче глюкозы в верхней части пробирки появляется желтая или красная окраска жидкости, а в нижней части — осадок коричнево-зеленоватого цвета.

Рисунок 2. Схема качественного определения глюкозы в моче (проба Гайнеса)

Определение глюкозы с помощью индикаторных полосок. 

Метод основан на окислении глюкозы специфическим ферментом глюкозооксидазой с образованием перекиси водорода, которая в присутствии пероксидазы разлагается и окисляет специальный краситель.

Бумажные полоски, пропитанные глюкозооксидазой, пероксидазой и красителем опускают в пробирку с мочой, сразу вынимают и оставляют на 2 минуты на пластмассовой пластинке.

При наличии в моче глюкозы полоски окрашиваются в синий цвет, интенсивность которого соответствует концентрации глюкозы.

Сравнивая окраску с прилагаемой к набору стандартной цветовой шкалой можно ориентировочно определить содержание глюкозы в моче.

Глюкозооксидазный метод, принцип которого описан выше, дает более точные результаты определения концентрации глюкозы в моче.

В результате реакции образуется окрашенное вещество, интенсивность окраски колориметрируют и по калибровочной кривой, построенной на основании определений стандартных растворов глюкозы, рассчитывают ее содержание в моче.

Кетоновые тела

Кетоновые тела (ацетон, ацетоуксусная и b-оксимасляная кислоты) являются промежуточными продуктами углеводного и жирового обмена. В норме, образуясь в небольшом количестве из ацетил-КоА, они почти полностью утилизируются в цикле трикарбоновых кислот (цикле Кребса).

При сахарном диабете и голодании усиливается утилизация жиров с образованием большого количества ацетил-КоА, который вследствие нарушений углеводного обмена не утилизируется и не используется в цикле трикарбоновых кислот.

В результате увеличивается содержание кетоновых тел, которые выделяются с мочой.

Кетоновые тела обладают выраженным токсическим действием на ЦНС.

Поэтому определение кетоновых тел в моче имеет важное диагностическое значение.

Проба Ланге 

Проба основана на свойстве натрия нитропруссида реагировать в щелочной среде с кетоновыми телами с образованием комплексных соединений, окрашенных в красно-фиолетовый цвет.

В пробирку с 3–5 мл мочи добавляют 5–10 капель свежеприготовленного 10% раствора натрия нитропруссида и 0,5 мл концентрированной уксусной кислоты и смешивают их.

После этого осторожно по стенке пробирки наслаивают 2–3 мл 25% раствора аммиака.

Если в течение 3 минут на границе двух жидкостей получается красно-фиолетовое кольцо, пробу считают положительной (рис. 3).

Рисунок 3. Схема качественного определения кетоновых тел в моче (проба Ланге). Красной стрелкой показано красно-фиолетовое кольцо, появляющееся на границе мочи и раствора аммиака

Проба Ротеры 

Проба основана на том же принципе образования окрашенных соединений, что и проба Ланге.

В пробирке смешивают 200 мг сухого аммония сульфата, 5 капель мочи и 2 капли раствора натрия нитропруссида.

На эту смесь осторожно наслаивают 10–15 капель водного раствора аммиака.

Фиолетово-красное кольцо на границе двух сред свидетельствует о наличии в моче кетоновых тел.

Причем интенсивность окраски кольца пропорциональна концентрации кетоновых тел в моче.

В клинической практике получили распространение также различные модификации экспресс-анализа кетоновых тел в моче, например с помощью таблеток или полосок бумаги, содержащих все необходимые для реакции компоненты.

На таблетку наносят 2 капли мочи и через определенное время, указанное в инструкции, сравнивают интенсивность фиолетового окрашивания с цветной шкалой, соответствующей различной концентрации кетоновых тел в моче.

В норме методами, описанными выше, кетоновые тела не обнаруживаются.

Наиболее частыми причинами кетонурии являются:

1. диабетический кетоацидоз;

2. длительное голодание (так называемая кетонемическая гипогликемия);

3. неукротимая рвота;

4. несбалансированное безуглеводное питание (строгое ограничение углеводов при нормальном потреблении жиров);

5. состояния, связанные с повышенным метаболизмом (высокая лихорадка, тяжелый тиреотоксикоз и др.).

Билирубин в моче

У здорового человека методами, используемыми в клинике, билирубин в моче не обнаруживается.

Появление билирубина в моче (билирубинурия) — всегда явление патологическое.

Оно связано с проникновением через почечный барьер связанного (прямого) билирубина (билирубин-глюкуронида).

Несвязанный (непрямой) билирубин не проходит через неповрежденный почечный фильтр, так как адсорбирован белком (альбумином).

В клинической практике широко применяются качественные пробы на билирубин.

Большинство из них основаны на его окислении йодом или азотной кислотой с образованием биливердина, окрашенного в зеленый цвет.

Йодная проба (проба Розина). 

В качестве окислителя используется раствор Люголя или 1% спиртовой раствор йода. В пробирку с 3–4 мл мочи осторожно по стенке наслаивают 1–2 мл 1% спиртового раствора йода или раствора Люголя.

При наличии билирубина в моче на границе между двумя жидкостями образуется зеленое кольцо.

Билирубинурия выявляется при двух видах желтух (паренхиматозной и обтурационной).

Определение уробилина в моче

Уробилиновые тела (уробилиноиды) являются промежуточными продуктами пигментного обмена.

Они представлены, главным образом, уробилиногеном (мезобилиногеном) и стеркобилиногеном.

В норме уробилиноиды в моче представлены следами стеркобилиногена (около 4-6 мг/с) и не обнаруживаются обычными качественными пробами.

Проба с сульфатом меди (проба Богомолова) 

Проба основана на взаимодействии уробилина с сульфатом меди, что приводит к образованию соединений, окрашенных в красновато-розовый цвет.

К 10–15 мл мочи приливают 2–3 мл насыщенного раствора сульфата меди.

При помутнении раствора в него добавляют несколько капель концентрированной соляной кислоты, через 5 мин добавляют 2–3 мл хлороформа, закрывают пробирку и встряхивают ее.

Если хлороформ окрашивается в розовый цвет, то концентрация уробилина в моче превышает норму.

Проба Флоренса

Чувствительная проба для выявления уробилиноидов.

При взаимодействии уробилина и соляной кислоты образуется соединение, окрашенное в красновато-розовый цвет.

К 10 мл мочи добавляют 3–4 капли концентрированной серной кислоты, смешивают, приливают 2–3 мл эфира и, плотно закрыв пробирку пробкой, осторожно смешивают, не взбалтывая.

В другую пробирку наливают 2 мл концентрированной соляной кислоты.

Пипеткой отсасывают из первой пробирки эфирную вытяжку и наслаивают ее на соляную кислоту.

На границе двух жидкостей при наличии уробилина образуется розовое кольцо, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации уробилина.

Запомните!

В норме описанными выше способами уробилин в моче не определяется, хотя иногда при проведении достаточно чувствительной пробы Флоренса на границе между двумя жидкостями можно заметить легкое розовое окрашивание.

Выделение уробилиноидов с мочой обнаруживают при следующих патологических заболеваниях и синдромах:

1. при паренхиматозной желтухе (преимущественно за счет мезобилиногена, не разрушающегося в печени);

2. при гемолитической желтухе (преимущественно за счет стеркобилиногена, в существенно большем количестве образующегося при усиленном распаде эритроцитов);

3. при заболеваниях кишечника, сопровождающихся усиленной реабсорбцией стеркобилиногена в кишечнике (энтероколиты, запоры, кишечная непроходимость).

mkli-bioximia.com

Белок в моче – методы определения и границы нормы (современное состояние проблемы)

26.02.2009

В норме белок выделяется с мочой в относительно небольшом количестве, обычно не более 100–150 мг/сут. 

Суточный диурез у здорового человека составляет 1000–1500 мл/сут; таким образом, концентрация белка в физиологических условиях составляет 8–10 мг/дл (0,08-0,1 г/л).

Общий белок мочи представлен тремя основными фракциями – альбуминами, мукопротеинами и глобулинами.

Альбумин мочи – это та часть альбумина сыворотки крови, которая была профильтрована в клубочках и не была реабсорбирована в почечных канальцах; в норме экскреция альбумина в моче составляет менее 30 мг/сут. Иным главным источником белка в моче служат почечные канальцы, особенно дистальная часть канальцев. Эти канальцы секретируют две третьих общего количества мочевого белка; из этого количества примерно 50% представлено гликопротеидом Тамма‑Хорсфалла, который секретируется эпителием дистальных канальцев и играет важную роль в формировании мочевых камней. Иные белки присутствуют в моче в незначительном количестве и происходят из профильтровавшихся через почечный фильтр низкомолекулярных белков плазмы, которые не реабсорбируются в почечных канальцах, микроглобулинов из эпителия почечных канальцев (RTE), а также простатического и влагалищного отделяемого. 

Протеинурия, то есть увеличение содержания белка в моче – один из наиболее значимых симптомов, отражающий поражение почек. Однако и целый ряд других состояний также может сопровождаться протеинурией. Поэтому различают две основные группы протеинурий: почечную (истинную) и внепочечную (ложную) протеинурию. 

При почечной протеинурии белок проникает в мочу непосредственно из крови вследствие повышения проницаемости гломерулярного фильтра. Почечная протеинурия часто встречается при гломерулонефрите, нефрозе, пиелонефрите, нефросклерозе, амилоидозе почек, различных формах нефропатий, например нефропатии беременных, лихорадочных состояниях, гипертонической болезни и т.д. Протеинурия может обнаруживаться и у здоровых людей после тяжелых физических нагрузок, переохлаждения, психологического стресса. У новорожденных в первые недели жизни наблюдается физиологическая протеинурия, а при астении у детей и подростков в сочетании с быстрым ростом в возрасте 7-18 лет возможна ортостатическая протеинурия (в вертикальном положении тела). 

При ложной (внепочечной) протеинурии источником белка в моче является примесь лейкоцитов, эритроцитов, клеток эпителия мочевых путей уротелия. Распад этих элементов, особенно резко выраженный при щелочной реакции мочи, приводит к попаданию белка в мочу, уже прошедшую почечный фильтр. Особенно высокую степень ложной протеинурии дает примесь крови в моче, при профузной гематурии она может достигать 30 г/л и более. Заболевания, которые могут сопровождаться внепочечной протеинурией - мочекаменная болезнь, туберкулез почки, опухоли почки или мочевых путей, циститы, пиелиты, простатиты, уретриты, вульвовагиниты. 

Клиническая классификация включает легкую протеинурию (менее 0,5 г/сут.), умеренную (от 0,5 до 4 г/сут.), или тяжелую (более 4 г/сут.). 

У большинства пациентов с заболеваниями почек, такими, как острый гломерулонефрит или пиелонефрит выявляют умеренную протеинурию, но больные с нефротическим синдромом обычно выделяют с мочой более 4 г белка ежедневно.

Для количественного определения белка применяется широкий спектр методов, в частности, унифицированный метод Брандберга-Робертса-Стольникова, биуретовый метод, метод с применением сульфосалициловой кислоты, методы с использованием красителя кумасси синий,   красителя пирогаллоловый красный и др.

Использование различных методов определения белка в моче привело к тому, что в трактовке границ нормы содержания белка в моче возникла серьезная путаница. Поскольку наиболее часто в лабораториях используются 2 метода – с сульфосалициловой кислотой и красителем пирогаллоловый красный, рассмотрим проблему корректности границ норм именно для них. С позиции сульфосалицилового метода в нормальной моче содержание белка не должно превышать 0,03 г/л, с позиции же пирогаллолового – 0,1 г/л! Различия троекратные!!!

Низкие значения нормы концентрации белков в моче при использовании сульфосалицилового обусловлены следующими моментами:

  • калибровочная кривая строится по водному раствору альбумина. Моча по своему составу очень сильно отличается от воды: рН, соли, низкомолекулярные соединения (креатинин, мочевина и др). Вследствие этого по данным Альтшулера, Ракова и Ткачева ошибка определения белка в моче может быть 3-х кратной и более! Т.е. корректные результаты определения могут быть получены только в тех случаях, когда моча имеет очень низкий удельный вес и по своему составу и рН приближается к воде;
  • более высокая чувствительность сульфосалицилового метода к альбумину в сравнении с другими белками (в то время, как было упомянуто выше, альбумин в нормальных образцах мочи составляет не более 30% от общего белка мочи);
  • если pH мочи сдвинута в щелочную сторону, происходит нейтрализация сульфосалициловой кислоты, что так же является причиной   занижения результатов определения белка;
  • скорость седиментации преципитатов подвержена значительной вариации - при невысоких концентрациях белка преципитация замедлена, и ранняя остановка реакции приводит к занижению результата;
  • скорость реакции преципитации существенно зависит от перемешивания реакционной смеси. При высоких концентрациях белка активное встряхивание пробирки может приводить к образованию крупных хлопьев и их быстрому осаждению.

Все выше перечисленные особенности метода и приводят к значительному занижению определяемой в моче концентрации белка. При этом степень занижения сильно зависит от состава конкретной пробы мочи. Поскольку метод сульфосалициловой кислоты дает заниженные значения концентрации белка то и граница нормы для этого метода 0,03 г/л тоже занижена примерно в три раза в сравнении с данными, которые приводятся в зарубежных справочниках по клинической лабораторной диагностике.

Подавляющее большинство лабораторий западных стран отказались от применения сульфосалицилового метода для определения концентрации белка в моче и активно используют для этих целей пирогаллоловый метод. Пирогаллоловый метод определения концентрации белка в моче и других биологических жидкостях основан на фотометрическом принципе измерения оптической плотности окрашенного комплекса, образующегося при взаимодействии молекул белка с молекулами комплекса красителя пирогаллоловый красный и молибдата натрия (Pyrogallol Red–Molybdate complex).

Почему пирогаллоловый метод позволяет получать более точные результаты измерения концентрации белка в моче? Во-первых, за счет большей кратности разведения пробы мочи в реакционной смеси. Если в сульфосалициловом методе отношение проба мочи/реагент составляет 1/3, то в пирогаллоловом методе оно может быть в пределах от 1/12,5 до 1/60 в зависимости от варианта методики, что значительно уменьшает влияние состава мочи на результат измерения. Во-вторых, реакция протекает в сукцинатном буфере, то есть при стабильном рН. И, наконец, сам принцип метода, можно сказать, более «прозрачный». Молибдат натрия и краситель пирогаллоловый красный образуют комплекс с молекулой белка. Это приводит к тому, что молекулы красителя в свободном состоянии не поглощающие свет на длине волны 600 нм в комплексе с белком свет поглощают. Таким образом, мы как бы метим каждую молекулу белка красителем и в результате получаем, что изменение оптической плотности реакционной смеси на длине волны 600 нм четко коррелирует с концентрацией белка в моче. Причем, поскольку сродство пирогаллолового красного к разным фракциям белка практически одинаковое, метод позволяет определять общий белок мочи. Поэтому граница нормальных значений концентрации белка в моче составляет 0,1 г/л (она и указана во всех современных западных руководствах по клинико-лабораторной диагностике, в том числе и в «Клиническом руководстве по лабораторным тестам», под ред. Н. Тица). Сравнительные характеристики пирогаллолового и сульфосалицилового методов определения белка в моче представлены в Таблице 1.

В заключение, хотелось бы еще раз акцентировать внимание на том факте, что при переходе лаборатории с сульфосалицилового метода определения белка в моче на пирогаллоловый метод граница нормальных значений существенно повышается (с 0,03 г/л до 0,1г/л!). Об этом сотрудники лаборатории должны непременно поставить в известность врачей-клиницистов, т.к. при сложившейся ситуации диагноз протеинурия может быть поставлен только в том случае, когда содержание белка в моче превышает 0,1 г/л.

Список литературы.

  1. Альтшулер Б.Ю., Раков С.С., Ткачев Г.А. // Вопр. мед. химии. – 2001. – № 4. – C.426-438.
  2. Ким Ю.В., Потехин О.Е., Токар М.И., Шибанов А.Н. // Лаб. мед. – 2003. – № 6. – C.94-98.
  3. Клиническое руководство по лабораторным тестам, под ред. Н. Тица.- М.- Юнимед-пресс.-2003.- 942 с.
  4. Козлов А.В., Слепышева В.В. Методы определения белка в моче: возможности и перспективы // Сборник трудов VII ежегод. СПб нефрол. семинара. – СПб: ТНА. – 1999. – C.17-28.
  5. Пупкова В.И., Пикалов И.В., Хрыкина Е.Н., Харьковский А.В. // Новости «Вектор-Бест». – 2003. – № 4 (30).
  6. Chambers R.E., Bullock D.G., Whicher J.T. // Ann. Clin. Biochem. – 1991. – Vol. 28 (Pt 5). – P.467-473.
  7. Clinical Laboratury Medicine. Ed. by Kenneth D. McClatchey. – 2nd ed.-2001.- 1993p.
  8. Eppel G.A., Nagy S., Jenkins M.A., Tudball R.N., Daskalakis M., Balazs N.D.H., Comper W.D. // Clin. Biochem. – 2000. – Vol. 33. – P.487-494.
  9. Franke G., Salvati M., Sommer R.G. Composition and device for urinary protein assay and method of using the same // ПатентСША № 5326707. – 1994.
  10. Kaplan I.V., Levinson S.S. // Clin. Chem. – 1999. – Vol. 45. – P.417-419.
  11. Kashif W., Siddiqi N., Dincer H.E., Dincer A.P., Hirsch S. // Cleveland Clin. J. of Med. – 2003. – Vol. 70 (6). – P.535-547.
  12. Koerbin G, Taylor L, Dutton J, Marshall K, Low P, Potter JM. // Clin. Chem. – 2001. – Vol. 47. – P.2183-2184.
  13. Le Bricon T., Erlich D., Dussaucy M., Garnier J.P., Bousquet B. // Article in French. – Ann. Biol. Clin. (Paris). – 1998. – Vol. 56 (6). – P.719-723.
  14. Marshall T., Williams K.M. // Clin. Chem. – 2003. – Vol. 49 (12). – P.2111-2112.
  15. Pugia M., Newman D.J., Lott J.A., D’Mello L., Clark L., Profitt J.A., Cast T. // Clin. Chim. Acta. – 2002. – Vol. 326 (1-2). – P.177-183.
  16. Ringsrud K.M., Linne J.J. Urinalysis and body fluids: A ColorText and Atlas // Mosby. – 1995. – P.52-54.
  17. Shepard M.D., Penberthy L.A. // Clin. Chem. – 1987. – Vol. 33. – P.792-795.
  18. Williams K.M., Marshall T. // J. Biochem. Biophys. Methods. – 2001. – Vol. 47. – P.197-207.
  19. Williams K.M., Arthur S.J., Burrell G., Kelly F., Phillips D.W., Marshall T. // J. Biochem. Biophys. Methods. – 2003. – Vol. 57 (1). – P.45-55.

unimedao.ru

Методы определения белка в моче

Все методы определения белка в моче основаны на свертывании белка под воздействием химических или термических агентов. При наличии белка в моче появляется помутнение, степень которого зависит от количества белка.

А) качественные пробы определения белка в моче – являются обязательными.

1. Проба с азотной кислотой – в пробирку с 1-2 мл 50% р-ра азотной кислоты осторожно наслаивают равное количество мочи, стараясь не взбалтывать жидкость. В случае присутствия белка в моче на границе двух жидкостей появляется белое кольцо, лучше видное на черном фоне.

2. Проба с сульфасалициловой кислотой – в пробирку наливают 4-5 мл мочи и добавляют 8-10 капель реактива. При наличии белка в моче, в зависимости от его количества, могут отмечаться помутнения или выпадение хлопьевидного осадка.

3. Экспресс-тест (сухая диагностическая проба) – полоску индикаторной бумаги «Альбуфан» погружают в исследуемую мочу так, чтобы одновременно смочить обе индикаторные зоны (верхняя зона – для определения рН, нижняя – для определения белка). Через 2-3 сек полоску помещают на белую стеклянную пластинку. Оценку проводят через 60 сек после смачивания полоски мочой, пользуясь цветной шкалой, нанесенной на пенале с индикаторными полосками.

Б) количественные пробы – проводят в тех порциях мочи, где был обнаружен белок при его качественном определении; определение проводят в надосадочном слое после центрифугирования

Способ Брандберга-Робертса-Стольникова – в пробирку наливают 1-3 мл 50% р-ра азотной кислоты и острожно по стенке наслаивают такое же количество мочи. На секундомере засекают время. Если кольцо на границе жидкостей образуется сразу или раньше 2 мин после наслаивания, мочу необходимо развести водой. После чего производят повторое определение белка в разведенной моче. Разведение производят до тех пор, пока белое кольцо при наславивании разведенной мочи на азотную кислоту не появиться между 2-й и 3-й мин. Количество белка определяют путем умножения 0,033 промилле на степень разведения.

18. Техника взятия мазков на флору, гонококки, трихомонады, цитологическое исследование, КПИ.

Техника взятия мазков на флору: материал берется из цервикального канала и из уретры специальной щеточкой под визуальным контрлем. Полученную пробу немедленно помещают на предметное стекло и растирают.

Техника взятия мазков на трихомонады: вначале берут материал путем соскоба со слизистой уретры (после ее предварительного массажа в течение 1 мин о лонное сочленение) и заднего свода влагалища, затем обтирают влагалищную часть шейки матки стерильным тампоном, смоченным физраствором, убирают слизистую пробку, в цервикальный канал осторожно на глубину не более 1,0-1,5 см вводят зонд и берут соскоб со слизистой шейки матки.

Техника взятия мазков на гонококки: материал берется из уретры, бартолиниевых желез и парауретральных ходов после обтирания их ватным тампоном, смоченным физраствором, влагалищным пинцетом или специальным зондом. Из прямой кишки материал берется тупой ложечкой. При хронической и торпидной гонорее перед исследованием для повышения вероятности выявления возбудителя проводят провокацию.

Нельзя брать материал ватным тампоном и во время менструации.

Техника взятия мазков на цитологическое исследование: мазок берут с поверхности экзоцервикса, влагалища и вульвы с помощью шпателя, из эндоцервикса – с помощью щетки-эндобраша. Материал наносят тонким слоем на специально обработанное обезжиренное стекло и обрабатывают специальным составом во избежание высыхания клеток. Препараты окрашивают по методу Папаниколау (так называемый ПАП-мазок) и микроскопируют.

Кариопикнотический индекс – процентное отношение поверхностных клеток с пикнотическими ядрами к клеткам, имеющим везикулярные (непикнотические) ядра. КПИ в начале фолликулиновой фазы менструального цикла 25-30%, к моменту овуляции 60-70%, в лютеиновой фазе снижается до 25%.

uchenie.net

10 .Определение белка в моче

Данные исследования позволяют оценить функциональность почек, степень компенсации сахарного диабета, прогнозировать поздние осложнения, контролировать ход лечения.

У больных сахарным диабетом со временем нарушается выделительная функция почек, и они (почки) начинают пропускать в мочу полезные вещества, которые здоровые почки не пропускают. Одним из первых признаков почечной недостаточности является появление в моче белка (альбумина). В норме за сутки с мочой выделяется очень мало белка (до 50 мг/сутки), не диагностируемое обычными методами. При начальной форме почечной недостаточности выделение белка с мочой несколько увеличивается. Такое состояние называютмикроальбуминурией. Если количество белка в моче возрастает еще больше, то развивается макроальбумирурия (протеинурия).

11.Исследование на кетоновые тела

Данные исследования позволяют оценить степень компенсации сахарного диабета.

Кетоновые тела крови и мочи образуются в печени из продуктов распада жиров и некоторых аминокислот. Появление в моче кетоновых тел в сочетании с повышением глюкозы крови всегда свидетельствует о том, что в организме человека имеется резко выраженный дефицит инсулина, что бывает при сахарном диабете 1 типа. Появление кетоновых тел в моче больного сахарным диабетом - грозный симптом, свидетельствующий о выраженных нарушениях обмена веществ, и требующий неотложного лечения. Дальнейшее нарастание обменных нарушений и концентрации кетоновых тел в крови и моче при сахарном диабете может привести к развитию кетоацидотической комы. Появление кетоновых тел в моче у больных с длительно протекающим сахарным диабетом 2 типа указывает на истощение клеток поджелудочной железы, вырабатывающих инсулин, и служит для показанием назначения инсулинотерапии таким больным.

64.Гипоальбуминемия. Дифференциальная диагностика. Гипоальбуминеми я – это патологическое состояние, характеризующееся снижением уровня альбумина в сыворотке крови ниже 35 грамм/литр. Форма гипопротеинемии. В основном наблюдается при нефротическом синдроме, сепсисе, алиментарной дистрофии, почечной и печеночной недостаточности Клинические проявления Основным объективным проявлением являются генерализованные отёки. Данное состояние опасно также высоким риском изменения кислотно-основного равновесия плазмы крови. Это обусловлено тем, что альбумины входят в состав белкового буфера который, в свою очередь, является частью это системы. КЩР является одной из жестких констант организма и даже его незначительные изменения быстро сказываются на всем организме в целом. Причины : 1.сократилось производство Альбумина • Хронические заболевания печени (напр., хронический гепатит и цирроз печени) • Недостаточное потребление (напр., белка диеты и питания) • Пищеварения • Мальабсорбции 2.Увеличение потери Альбумина • Потери белка при нефропатии, вызванной амилоидоз или гломерулонефрита • Небольшие кишечные расстройства, вызывающие белка,-теряя энтеропатия (напр., lymphangiectasia, лимфома, воспалительные заболевания кишечника, и гистоплазмоз) • Экссудативные кожные поражения • Потеря крови (напр., внешние кровотечения). • Повторные abdominocentesis высокопротеиновых окатывало 3.Секвестрация в Полости Тела или Тканей • Воспалительный выпот (напр., острый панкреатит или перитонит) • Васкулопатии 4.Разное • Гиперглобулинемия • Разбавление В норме концентрация общего белка плазмы крови составляет 65—85 г/л. Снижение концентрации общего белка в крови ниже 65 г/л носит название гипопротеинемии. Общий белок представляет собой группу плазменных белков (белковые фракции). Белковые фракции выявляются при электрофорезе на различных носителях. Выделяют следующие фракции: альбумины, а,-, а2-, β- и γ-глобулины. Белковые фракции определяются различными методами: высаливание нейтральными солями, электрофоретическое фракционирование, иммунологические методы, седиментационный способ, хроматография, гель-фильтрация, осаждение этиловым спиртом при низкой температуре.

Электрофорез альбумина на фракции : Альбумин,  норма: 58-70

Альфа 1 глобулин,  (α 1 глобулин), норма: 1.5-4.1

Альфа 2 глобулин (α 2 глобулин), норма: 5.5 – 10.0

Бета-глобулин (β глобулин), норма: 8-13

Гамма глобулин (γ глобулин), норма: 10-19 Гипоальбуминемии бывают первичные (у новорождённых детей в результате незрелости печёночных клеток) и вторичные, обусловленные различными патологическими состояниями, аналогичными тем, что вызывают гипопротеинемию. В понижении концентрации альбуминов может также играть роль гемодилюция, например при беременности. Снижение содержания альбуминов ниже 22−24 г/л сопровождается развитием отёка лёгких.

Изменения фракции альбуминов.

Снижение фракции альбумина изза : 1. Нарушения питания; 2.Синдром мальабсорбции; 3.Болезни печени и почек; 4.Опухоли; 5. Коллагенозы; 6. Ожоги; 7. Гипергидратация; 8.Кровотечения; 9.Анальбуминемия; 10. Беременность. Изменения фракции α1-глобулинов.

Основные компоненты данной фракции включают α1-антитрипсин, α1-липопротеид, кислый α1-гликопротеид.

Увеличение фракции α1-глобулинов наблюдают при острых, подострых, обострении хронических воспалительных процессов; поражении печени; всех процессах тканевого распада или клеточной пролиферации.

Снижение фракции α1-глобулинов наблюдают при дефиците α1-антитрипсина, гипо-α1-липопротеидемии.

studfiles.net


Смотрите также