Кишечный антибиотик широкого спектра действия

границ | Трансплантация фекальной микробиоты, штаммы Commensal Escherichia coli и Lactobacillus johnsonii дифференциально восстанавливают популяции кишечных и системных адаптивных иммунных клеток после лечения антибиотиками широкого спектра действия

Введение

Приблизительно 10 ¹³ микроорганизмов, в совокупности известных как микробиота, находятся в желудочно-кишечном тракте человека (Sender et al., 2016) и все чаще получают заслуженное внимание в отношении их глубокого влияния на физиологию и благополучие хозяина млекопитающего. ,Состав микробиоты характеризуется обширными межиндивидуальными вариациями и, кроме того, зависит от многочисленных факторов, включая генетику (Org et al., 2015), способ доставки (Biasucci et al., 2010), возраст (Palmer et al., 2007 ), диета (Ericsson and Franklin, 2015), госпитализация (Penders et al., 2006), воздействие патогенами и / или антибиотиками (Buffie et al., 2012; Carding et al., 2015). Было показано, что бактерии, принадлежащие к типу Firmicutes , Bacteroidetes , Proteobacteria , Actinobacteria и Fusobacteria , составляют подавляющее большинство кишечной микробиоты млекопитающих (Eckburg et al.2005; Палмер и др., 2007; Hill et al., 2012), а плотность бактерий и разнообразие увеличиваются от проксимального отдела к дистальному отделу кишечника (Sommer and Backhed, 2013). Firmicutes являются грамположительными бактериями, которые включают большой класс Clostridia и молочнокислых бактерий (Zhang et al., 2015), в то время как Escherichia coli (грамотрицательные палочковидные бактерии, принадлежащие к семейству Enterobacteriaceae и тип Proteobacteria ) представляют собой преобладающий факультативный анаэробный член желудочно-кишечного тракта млекопитающих (Finegold et al.1983; Tenaillon et al., 2010). В микробиоте тонкого кишечника преобладают семейства Lactobacillaceae и Enterobacteriaceae , тогда как виды из семейств Bacteroidaceae , Prevotellaceae , Rikenellaceae , Lachnospocacecaces canonacecacet (80007) могут быть обнаружены в -канадских семенах (80007). и др., 2016). В то время как микробиота имеет первостепенное значение для многочисленных метаболических процессов, включая синтез витаминов (LeBlanc et al., 2013) и переваривание пищевых соединений (Backhed et al., 2005), убедительные доказательства указывают на его влияние на созревание, развитие и функцию врожденной и адаптивной иммунной системы хозяина (Macpherson and Harris, 2004; Sommer и Backhed , 2013).

Молочнокислые бактерии выполняют важные функции в модуляции иммунных реакций и успешно используются в качестве пробиотиков при воспалительных состояниях у мышей и мужчин. Например, Lactobacillus rhamnosus GG оказывает профилактическое и терапевтическое действие при атопической экземе и дерматите (Isolauri et al.2000; Kalliomaki et al., 2001, 2003; Вильянен и др., 2005). Кроме того, лечение мышей с дефицитом IL-10 L. plantarum ослабляло тяжесть воспаления толстой кишки путем снижения уровней IL-12p40 в слизистой оболочке и уровней IFN-γ (Schultz et al., 2002). В нашей предыдущей работе мы могли бы далее продемонстрировать, что один штамм commensal L. johnsonii способен ослаблять как слизистую оболочку кишечника, так и системные провоспалительные иммунные ответы при мышиной инфекции энтеропатогеном Campylobacter jejuni (Bereswill et al., 2017). Квон и соавт. (2010) предположили, что наблюдаемые полезные противовоспалительные свойства могут быть вызваны индукцией регуляторных DC и регуляторных T-клеток (Treg).

Грамотрицательные комменсалы, такие как члены семейства Enterobacteriaceae , как правило, игнорируются, но, тем не менее, могут являться мощными иммуномодуляторами (Zeuthen et al., 2006). Лучше всего это подтверждается пробиотическим штаммом E. coli Nissle 1917, который убедительно доказал свою эффективность в лечении язвенного колита и рассматривается как эффективная альтернатива стандартной поддерживающей терапии, т.е.мезалазин (Kruis et al., 2004; Henker et al., 2008; Schultz, 2008).

Важно, что Hessle et al. (2000, 2005) и Skovbjerg et al. (2010) показали различное влияние грамположительных и грамотрицательных бактерий на модуляцию моделей производства цитокинов, учитывая, что совместное культивирование in vitro человеческих РВМС с грамположительными бактериями приводит к повышению уровня IL-12. , IL-1β, IFN-γ и TNF, тогда как грамотрицательные бактерии скорее индуцируют IL-6, IL-8 и IL-10. Напротив, было показано, что из полученных из моноцитов человеческих DC вырабатывает сопоставимые уровни IL-12 и TNF в ответ на комменсальные грамположительные и грамотрицательные бактерии (Karlsson et al.2004; Zeuthen et al., 2006).

Исследования на мышах дополнительно подчеркивают влияние отдельных видов бактерий на отдельные популяции иммунных клеток. Например, были выявлены сегментированные нитчатые бактерии (SFB), которые индуцируют размножение клеток Th27, продуцирующих IL-17 (Ivanov et al., 2008), в то время как видов Clostridium кластеров IV и XIVa способствуют накоплению Treg в толстой кишке. propria (LP) мышей (Atarashi et al., 2011). Дифференцировка CD4 + T-клеток в Treg локально в LP, а также в кровотоке также подтверждается TLR-2-опосредованным восприятием грамотрицательной бактерии Bacteroides fragilis (Round et al.2011). Кроме того, было показано, что лечение мышей IL-10 ^{- / -} L. plantarum ослабляет тяжесть воспаления толстой кишки путем снижения уровней IL-12p40 в слизистой оболочке и уровней IFN-γ (Schultz et al., 2002). Однако выяснение дифференциального влияния грамположительных и грамотрицательных комменсалов на гомеостаз иммунных клеток в моделях in vivo и выявление видоспецифических механизмов иммуномодуляции остается трудным и сложным, но все же представляет большой интерес.

В наших предыдущих работах мы показали, что у нормально развитых мышей, лишенных микробиоты кишечника в результате пятикратной антибиотикотерапии (т.е. вторичных абиотических мышей, мышей ABx), обнаруживаются многочисленные изменения подмножеств слизистой оболочки кишечника и системных иммунных клеток, которые, однако, могут , почти полностью восстанавливаться путем реинтродукции кишечных антигенов посредством трансплантации фекальной микробиоты (FMT) (Ekmekciu et al., 2017a, b). Кроме того, мы смогли продемонстрировать, что реколонизация мышей ABx с VSL # 3, пробиотической смесью, состоящей из восьми видов бактерий (а именно Streptococcus thermophilus , Bifidobacterium breve , B.longum , B. infantis , Lactobacillus acidophilus , L. plantarum , L. paracasei и L. delbrueckii subsp. bulgaricus ), вызывает выработку IL-10 лимфоцитами в тонкой и толстой кишке, LP, MLN и селезенке, но не влияет на продукцию провоспалительных цитокинов (Ekmekciu et al., 2017a, b). Влияние пробиотиков на выработку цитокинов было тщательно изучено, и было высказано предположение, что некоторые штаммы могут стимулировать главным образом выработку IL-12, индуцируя тем самым иммунные ответы типа Th2, которые, как известно, защищают от патогенов.Другие штаммы, однако, более эффективно влияли на выработку противовоспалительного IL-10, ограничивая, таким образом, чрезмерные иммунные реакции, наблюдаемые, например, при аутоиммунных и аллергических заболеваниях (Fujiwara et al., 2004; Foligne et al., 2007; Shida и др., 2011).

Niess et al. (2008) ранее дополнительно рассмотрели роль комменсальных организмов в рекрутировании провоспалительных цитокин-продуцирующих CD4 + клеток в собственной толстой кишке и предположили, что эти типы клеток могут вносить вклад в иммунопатогенез колита.Тем не менее, точный баланс между про- и противовоспалительными иммунными реакциями на слизистых и системных участках имеет первостепенное значение для позвоночного хозяина. Например, уменьшение клеточного компартмента Th27, продуцирующего IL-17, играющего ключевую роль в защите от бактериальных и грибковых патогенов (Aujla et al., 2007), может объяснить повышенную восприимчивость мышей, истощенных по микробиоте, к патогенам (Croswell et al., 2009; Stiemsma et al., 2014).

В настоящем исследовании мы исследовали роль двух важных представителей грамотрицательных (а именно E.coli ) и грамположительные (а именно L. johnsonii ) комменсалы, оба получены из кишечной микробиоты здоровых мышей, при восстановлении числа различных подмножеств иммунных клеток после обработки антибиотиками по сравнению с FMT у мышей C57Bl / 6j ABx. Чтобы решить эту проблему, мы проанализировали иммунные ответы, вызываемые лимфоцитами в тонком и толстом кишечном ЛП, MLN и селезенке мышей, истощенных микробиотой, при повторной ассоциации с E.coli или L. johnsonii и при FMT в день (d) 7 и d28 после реколонизации.Кроме того, мы исследовали паттерны производства цитокинов, оценивая секрецию TNF, IFN-γ, IL-17, IL-22 и IL-10 лимфоцитами CD4 + в соответствующих компартментах.

Материалы и методы

Заявление об этике

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Европейским руководством по защите животных (2010/63 / EU) с одобрения комиссии по экспериментам на животных, возглавляемой «Landesamt für Gesundheit und Soziales» (LaGeSo, Берлин, Германия, регистрационные номера G0097 / 12 и G0184 / 12).Благосостояние животных проверяли два раза в день, оценивая клинические состояния, включая потерю веса.

Поколение вторичных абиотических (Gnotobiotic) мышей

Всех животных разводили, выращивали и содержали в помещениях «Forschungseinrichtungen für Experimentelle Medizin» (FEM, Charité - University Medicine Berlin, Германия) в особых условиях отсутствия патогенов (SPF). Вторичных абиотических мышей генерировали путем пятикратного введения антибиотика в течение 8 недель в питьевой воде, как описано ранее (Heimesaat et al.2006; Бересвилл и др., 2011; Фибигер и др., 2016; Ekmekciu et al., 2017a, b).

Бактериальная реколонизация

За три дня до экспериментов по бактериальной реколонизации коктейль с антибиотиками был изъят и заменен стерильной питьевой водой ( ad libitum ). Успешное истощение кишечной микробиоты было подтверждено, и FMT выполнялся, как описано ранее (Ekmekciu et al., 2017a, b). Кроме того, вторичных абиотических мышей реколонизировали с 10 ⁹ КОЕ или E.coli или L. johnsonii в 0,3 мл PBS (Gibco Life Technologies, Пейсли, Великобритания) через желудочный зонд в день 0. Примененный штамм E.coli представляет собой комменсальный изолят, полученный из наивного условно колонизированного дикого типа C57BL / 6j мыши и не экспрессировали известные факторы вирулентности, такие как stx 1 и 2, hlyA, cspA, catA, katA и astA, как подтверждено в контрольной лаборатории (Heimesaat et al., 2007; Haag et al., 2012). Штамм L. johnsonii был первоначально выделен из фекалий здоровой самки 3-месячной мыши дикого типа C57BL / 6j, как описано ранее (Bereswill et al., 2017). Для FMT были собраны свежие образцы мышиных фекалий у 10 контрольных мышей SPF, соответствующих возрасту и полу, собранные, растворенные в 10 мл стерильного PBS и супернатант, перорально нанесенный через желудочный зонд (в 0,3 мл PBS) для восстановления вторичного абиотика (то есть гнотобиотика) мыши со сложной микробиотой кишечника, как показано ранее (Heimesaat et al., 2006; Ekmekciu et al., 2017a, b).

Процедуры отбора проб

Мышей умерщвляли обработкой изофлураном (Abbott, Greifswald, Germany) в d7 или d28 после бактериальной реколонизации.Образцы просвета толстой кишки, а также ex vivo биопсий из селезенки, MLN, подвздошной кишки и толстой кишки были взяты в стерильных условиях. Образцы кишечника собирали параллельно для микробиологического и иммунологического анализа.

Количественный анализ бактериальной колонизации

Общая кишечная нагрузка E. coli и L. johnsonii была определена количественно в образцах фекалий и толстой кишки через некоторое время после реколонизации или после вскрытия. Соответствующие образцы растворяли в PBS и серийные разведения наносили на соответствующие твердые культуральные среды: E.coli был обнаружен на агаре Columbia с добавлением 5% овечьей крови и агара MacConkey (Oxoid, Wesel, Germany) после аэробной инкубации при 37 ° C в течение 48 часов. L. johnsonii нагрузок были определены на агаре Columbia с добавлением 5% овечьей крови, на агаре Columbia-CNA с добавлением колистина и налидиксовой кислоты и агара MRS (все от Oxoid) параллельно и инкубированы в микроаэробных и обязательных анаэробных условиях (в банках с использованием Газовые пакеты CampyGen и AnaeroGen соответственно, оба от Oxoid) при 37 ° C в течение не менее 2 дней.Бактериальные виды были идентифицированы в соответствии с их типичными морфологическими проявлениями и биохимическими свойствами. Предел обнаружения жизнеспособных бактерий составлял ≈100 КОЕ / г.

Выделение лимфоцитов из селезенки и брыжеечных лимфатических узлов

Суспензии отдельных клеток получали из селезенки и MLN, и эритроциты удаляли из образцов селезенки с помощью 1,66% хлорида аммония. Все образцы ресуспендировали в объемах 5 мл (селезенка) и 2 мл (MLN) PBS / 0,5% BSA (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, United States) и подвергнут дальнейшей обработке (Cording et al., 2013).

Lamina Propria Изоляция лимфоцитов

Выделение лимфоцитов Lamina propria следовало стандартному протоколу с небольшими модификациями, как описано ранее (Sheridan and Lefrancois, 2012; Ekmekciu et al., 2017b). Вкратце, кишечник разрезали на кусочки по 0,5 см и дважды инкубировали в 25 мл 1 мМ дитиоэритрита (DTE; Carl Roth) в сбалансированном солевом растворе Хенкса (HBSS; Gibco) в течение 20 минут при 37 ° C при 220 об / мин.После этого кишечник вводили в раствор 1,3 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA; Life Technologies, Eugene, OR, United States) в HBSS и снова дважды встряхивали здесь в течение 30 минут при 37 ° C при 220 об / мин. После каждой инкубации слой эпителиальных клеток, содержащий интраэпителиальные лимфоциты, удаляли путем интенсивного встряхивания и пропускания через сито с ячейками размером 70 мкм и добавляли новый раствор (DTE или EDTA). После второй инкубации с ЭДТА клетки промывали RPMI 1640 (Gibco), содержащим 5% фетальной сыворотки теленка (FCS; Biochrom, Berlin, Germany), и затем помещали в 35 мл расщепляющего раствора, содержащего 0.5 мг / мл коллагеназы А (Roche, Мангейм, Германия), 0,5 мг / мл ДНКазы I (Roche), 10% FCS, 1 мМ каждого CaCl ₂ и MgCl ₂ (оба Карл Рот) в RPMI 1640 ( Гибко). Пищеварение проводили через инкубацию в течение 45 мин при 37 ° С и 220 об / мин. После инкубации переваренные ткани промывали в RPMI с добавлением 5% FCS и центрифугировали в течение 6 минут при 4 ° C и 350 × г, . Осадки ресуспендировали в 5 мл 44% перколла (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) и наносили на 5 мл 67% перколла в 15-мл пробирку Falcon.Разделение градиента перколла проводили центрифугированием при 600 × г, в течение 20 минут при комнатной температуре. LPL собирали из интерфазы, промывали один раз и суспендировали в 1 мл PBS / 0,5% BSA.

Поверхностные и внутриклеточные окрашивания и проточная цитометрия

Окрашивание поверхности проводили с использованием смеси следующих антител: FITC-анти-CD4 (клон RM4-5; 1: 200), PerCP-анти-CD8 (клон 53-6.7; 1: 100), PacBlue-анти-B220 (Клон RA3-6B2, 1: 200), APC-Cy7-анти-CD25 (клон PC61, 1: 200), PE-анти-CD44 (клон IM7, 1: 200), APC-анти-CD86 (клон B7- 2, 1: 200) (все из BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния, США).

Для внутриклеточного окрашивания клеток селезенки MLN и LP кишечника повторно стимулировали в течение 5 ч с помощью 10 нг / мл форбол миристатацетата (PMA) и 1 мкг / мл иономицина в инкубаторе для тканевых культур при 37 ° C (оба Sigma-Aldrich) , Брефельдин A 10 мкг / мл (Sigma-Aldrich) добавляли к клеточным суспензиям через 1 ч после поликлональной рестимуляции. Затем клетки обрабатывали набором LIVE / DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain (жизненные технологии) и в дальнейшем фиксировали 2% параформальдегидом (PFA; Sigma-Aldrich) в течение 20 минут при комнатной температуре.Клетки окрашивали в 0,5% сапонине (Sigma-Aldrich) с использованием смеси следующих антител: PacBlue-Anti-CD4 (клон RM4-5; 1: 400), PE-Cy7-анти-IFN-γ (клон XMG 1.2; 1: 400), APC-Cy7-анти-TNF-α (клон MP6-XT22; 1: 400) (все три из BD Biosciences), FITC-анти-IL17A (клон TC11-18h20.1; 1: 200, BioLegend , Сан-Диего, Калифорния, США), PE-анти-IL10 (клон JESS-16E3; 1: 100), APC-анти-IL22 (клон IL22JOP; 1: 100) (оба из eBioscience). После стробирования лимфоцитов и исключения дублетов в дальнейшие анализы были включены только живые клетки.Клетки CD4 и CD8 были стробированы на живых клетках, тогда как клетки CD86 + (активированные дендритные) были идентифицированы в компартменте CD4-CD8. Все данные были получены на анализаторе MACSQuant (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Германия) и проанализированы с помощью FlowJo Software v10.1 (Tree star, Ashland, OR, United States).

Статистический анализ

Медианы, средние значения, среднеквадратичные отклонения (SD) и уровни значимости были определены с использованием теста Манна – Уитни U или одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с тестом Tukey post hoc для множественных сравнений (GraphPad Prism Software v6, La). Джолла, Калифорния, США), как указано.Двусторонние значения вероятности ( p ) ≤ 0,05 считались значимыми. Эксперименты были воспроизведены дважды и показаны объединенные данные ( n = 8–15 на группу).

Результаты

Кинетика плотности кишечной колонизации после реколонизации вторичных абиотических мышей с E. coli или L. johnsonii

В настоящем исследовании мы исследовали иммуномодулирующие свойства типичных грамотрицательных или грамположительных видов кишечных бактерий (а именно, E.coli и L. johnsonii соответственно) по сравнению со сложной микробиотой кишечника у мышей, которых лечили антибиотиками широкого спектра действия. Для решения этой проблемы традиционно выращенных мышей подвергали пятикратному коктейлю антибиотиков, делая их вторичными абиотиками (Ekmekciu et al., 2017a, b), и после достаточного периода вымывания мышей ABx перорально реколонизировали с соответствующими бактериальными видами или комплексом кишечника. микробиота по FMT. Важно, что состав кишечной микробиоты мышей ABx, которые были подвергнуты FMT, был сопоставим с наивными обычными колонизированными аналогами, как подтверждено ранее (Ekmekciu et al., 2017a, b). Уже через 3 дня после первоначальной реколонизации мы оценивали эффективность кишечной колонизации соответствующих видов с течением времени (рис. 1). Культурный анализ образцов кала показал, что E. coli (Рисунок 1A) и L. johnsonii (Рисунок 1B) стабильно колонизировали кишечный тракт мыши, оба с высокими срединными нагрузками> 10 ⁸ КОЕ на грамм фекалий до вскрытия в д28. Следует отметить, что ни одно из вмешательств, проводимых в этом исследовании (то есть лечение антибиотиками, реколонизация с E.coli / (L. johnsonii , FMT) приводил к любым неблагоприятным клиническим эффектам у мышей, таким как истощение, диарея, появление крови в кале или микроскопические признаки воспаления кишечника, включая эпителиальный апоптоз (данные не показаны).

РИСУНОК 1. Кинетика плотности кишечной бактериальной колонизации после бактериальной реколонизации вторичных абиотических мышей. Вторичные абиотические мыши были получены путем лечения антибиотиками широкого спектра действия и перорально реколонизированы с (A) E.coli (открытые квадраты) или (B) L. johnsonii (открытые кружки) в день (d) 0, как описано в разделе «Материалы и методы». Плотность бактериальной колонизации оценивали в образцах фекалий (колониеобразующие единицы на грамм, КОЕ / г) с течением времени после реколонизации, как указано культурой. Медианы (черные полосы) указаны. Данные были объединены из трех независимых экспериментов.

Т-клеточных популяций в мышечных кишечных и системных отделениях после FMT или реколонизации вторичных абиотических мышей с E.coli или L. johnsonii

Чтобы исследовать влияние E. coli и L. johnsonii на сложную кишечную микробиоту на различные популяции иммунных клеток после истощения антибиотической микробиоты, мы выделили лимфоциты из тонкой и толстой кишечной ЛП, MLN и селезенки и проанализировали определенные популяции иммунных клеток. с помощью проточной цитометрии на d7 и d28 после реколонизации. Во-первых, мы проанализировали лимфоциты CD4 + (рисунки 2, 3) и CD8 + (дополнительные рисунки S1, S2) и оценили оба относительных содержания (т.е.например, проценты) и абсолютные числа клеток соответствующих популяций иммунных клеток. После лечения антибиотиками количество CD4 + Т-лимфоцитов-помощников уменьшилось как в тонком, так и в толстом кишечнике, но могло быть полностью восстановлено после FMT ( p <0,05–0,001; Рисунки 2A, B). У мышей с E. coli или L. johnsonii наблюдалось несколько более высокое процентное содержание клеток CD4 + в их тонкой кишке без существенных уровней (н.с. против ABx; фиг. 2A). В толстой кишке, однако, E.Реколонизация coli приводила к более высоким частотам клеток CD4 + на d7, но снова снижалась до d28 (рис. 2А). Интересно, что в MLN процент лимфоцитов CD4 + был наименьшим при d7 после FMT ( p <0,05 по сравнению с N; Рисунок 2C), но затем достиг наивных уровней. В селезенках колонированных мышей L. johnsonii мы обнаружили более высокие частоты CD4 + лимфоцитов, чем у их с колонизированными аналогами E.coli при d28 ( p <0.05-0.01; Рисунок 2D). Кроме того, повторная колонизация L. johnsonii привела к наибольшему абсолютному количеству CD4 + клеток в тонкой кишке мыши ( p <0,05–0,001; Фигура 3А). На d7 после реколонизации можно было наблюдать более высокое количество CD4 + лимфоцитов в LP толстой кишки по сравнению с мышами ABx ( p <0,05-0,01; фигура 3B), но снижалось до d28. Примечательно, что в d28 после L. johnsonii колонизированных мышей также показали наибольшее количество CD4 + клеток в селезеночном (и, следовательно, системном) компартменте ( p <0).05-0.001; Рисунок 3D).

РИСУНОК 2. Процент CD4 + клеток в кишечнике и системных компартментах вторичных абиотических и реколонизированных мышей. Вторичных абиотических мышей получали путем лечения антибиотиками широкого спектра действия и перорально реколонизировали через желудочный зонд. Впоследствии лимфоциты из тонкой кишки и толстой кишки собственной пластинки, MLN и селезенки были выделены и проанализированы с помощью проточной цитометрии, как описано в «Материалах и методах». Процент популяции CD4 + лимфоцитов в тонкой кишке (A), , толстой кишке (B), , (C), MLN и селезенке (D) наивных обычных мышей (N), вторичных абиотических мышей ( ABx) и мышей повторно связывают либо с E.coli (Ec), L. johnsonii (Lj) или комплексная кишечная микробиота с помощью FMT на d7 и d28 постреколонизации. Столбцы обозначают средства + SD. Указаны уровни значимости (значения p ), определенные с помощью одностороннего теста ANOVA с последующим тестом после коррекции Тьюки для множественных сравнений. Значительные различия по сравнению со вторичными абиотическими мышами отмечены звездочками ( ^∗ p <0,05; ^∗∗ p <0,01; ^∗∗∗ p <0.001). Данные были объединены из трех независимых экспериментов.

РИСУНОК 3. Абсолютное количество клеток CD4 + в кишечном и системном компартментах вторичных абиотических и реколонизированных мышей. Вторичных абиотических мышей получали путем лечения антибиотиками широкого спектра действия и перорально реколонизировали через желудочный зонд. Впоследствии лимфоциты из тонкой кишки и толстой кишки собственной пластинки, MLN и селезенки были выделены и проанализированы с помощью проточной цитометрии, как описано в «Материалах и методах.Концентрации CD4 + лимфоцитов в тонкой кишке (A), , толстой кишке (B), , (C), MLN и селезенке (D) наивных обычных мышей (N), вторичных абиотических мышей (ABx) и мыши, повторно ассоциированные либо с E.coli (Ec), L. johnsonii (Lj), либо с комплексной кишечной микробиотой посредством FMT на d7 и d28 после реколонизации. Столбцы обозначают средства + SD. Указаны уровни значимости (значения p ), определенные с помощью одностороннего теста ANOVA с последующим тестом после коррекции Тьюки для множественных сравнений.Значительные различия по сравнению со вторичными абиотическими мышами отмечены звездочками ( ^∗ p <0,05; ^∗∗ p <0,01; ^∗∗∗ p <0,001). Данные были объединены из трех независимых экспериментов.

Интересно, что вызванное истощением микробиоты уменьшение количества CD8 + -клеток в ЛП тонкого и толстого кишечника сопровождалось увеличением этих клеток в селезенке ( p <0.01–0,001 ABx против наивного; Дополнительные рисунки S1A, B, D). Моноколонизация одного штамма может восстановить эту клеточную популяцию в тонкой кишке довольно поздно, то есть до d28 после реколонизации либо E. coli , либо L. johnsonii ( p <0,05–0,001; дополнительная фигура S1). Примечательно, что ни колонизация E. coli , ни L. johnsonii не повлияли на снижение числа клеток CD8 + в толстой кишке, которые могли быть восстановлены только после FMT в d28 (дополнительная фигура S1B).На d7 после FMT у мышей наблюдалась самая низкая частота CD8 + клеток в их MLN, которая, однако, увеличивалась до d28 (дополнительная фигура S1C). Кроме того, в d7 после любой реколонизации у мышей наблюдался более низкий процент клеток селезенки CD8 +, чем у их аналогов ABx ( p <0,05–0,001; дополнительная фигура S1D). Этот эффект, однако, может сохраняться с течением времени только у реколонизированных мышей E.coli . Примечательно, что у мышей, несущих одиночные комменсальные виды в кишечнике, было более высокое число CD8 + лимфоцитов в LP тонкого кишечника при d28 по сравнению с мышами, которые подвергались FMT ( p <0.05-0.001; Дополнительный рисунок S2A). Однако до d7 только L. johnsonii , но не E.coli , могли в достаточной степени восстанавливать вызванные антибиотиками сниженные лимфоциты CD8 + ободочной кишки ( p <0,01 по сравнению с ABx; дополнительная фигура S2B). В соответствии с селезеночными CD4 + лимфоцитами, наибольшие количества селезеночных CD8 + лимфоцитов могут быть обнаружены у L. johnsonii колонизированных мышей при d28 после реколонизации ( p <0,001; дополнительная фигура S2D).

Активированные T-клетки (включая Treg), T-клетки памяти / эффектора и активированные дендритные клетки в мышечных кишечных и системных отделениях после FMT или реколонизации вторичных абиотических мышей с E.coli или L. johnsonii

Мы расширили наши исследования, проанализировав статус активации определенных популяций иммунных клеток. Поэтому мы окрашивали поверхностные маркеры CD25 (рисунок 4), CD44 (рисунок 5 и дополнительный рисунок S3) и CD86 (дополнительный рисунок S4), характерные для активированных T-клеток (включая Treg), T-клеток памяти / эффектора и активированных DC соответственно (Sprent и Surh, 2002; Wallet et al., 2005; Ostman et al., 2006). Лечение антибиотиками широкого спектра действия привело к значительному снижению содержания CD4 + CD25 + во всех анализируемых иммунологических компартментах (фиг. 4A-D).На d7 после FMT у мышей наблюдался самый высокий процент клеток CD4 + CD25 +, которые были даже выше, чем у наивных необработанных контролей SPF. Тем не менее, как E. coli , так и L. johnsonii вызывали значительное увеличение экспрессии CD25 в лимфоцитах, полученных из тонкой кишки, толстой кишки и селезенки, уже в d7 после реколонизации ( p <0,05–0,001 по сравнению с ABx; Фигуры 4А, В, D), тогда как, в частности, L. johnsonii оказали более выраженный эффект, чем E.coli в толстой кишке при d7 ( p <0,05–0,001 против Ec; рис. 4B). Более того, только L. johnsonii были способны восстановить CD4 + CD25 + клетки в MLN ( p <0,001 против ABx; фигура 4C).

РИСУНОК 4. Активированные Т-клетки (включая Treg) в кишечном и системном компартментах вторичных абиотических и реколонизированных мышей. Вторичных абиотических мышей получали путем лечения антибиотиками широкого спектра действия и перорально реколонизировали через желудочный зонд.Впоследствии лимфоциты из тонкой кишки и толстой кишки собственной пластинки, MLN и селезенки были выделены и проанализированы с помощью проточной цитометрии, как описано в «Материалах и методах». Частоты активированных Т-клеток (включая Treg, CD4 + CD25 +, стробированные на CD4 + -клетках) в тонкой кишке (A), , толстой кишке (B), (C), MLN и селезенке (D) наивные обычные мыши (N), вторичные абиотические мыши (ABx) и мыши, повторно связанные либо с E. coli, (Ec), л.johnsonii (Lj) или комплексная кишечная микробиота с помощью FMT на d7 и d28 постреколонизации изображены. Столбцы обозначают средства + SD. Указаны уровни значимости (значения p ), определенные с помощью одностороннего теста ANOVA с последующим тестом после коррекции Тьюки для множественных сравнений. Значительные различия по сравнению со вторичными абиотическими мышами отмечены звездочками ( ^∗ p <0,05; ^∗∗ p <0,01; ^∗∗∗ p <0.001). Данные были объединены из трех независимых экспериментов.

РИСУНОК 5. CD4 + Т-клетки памяти / эффектора в кишечном и системном компартментах вторичных абиотических и реколонизированных мышей. Вторичных абиотических мышей было

.

---

Смотрите также

• 
  Фастум гель показания к применению
• 
  Как быстро избавиться от мозолей на пальцах ног в домашних условиях
• 
  Суточный белок в моче при беременности как собирать
• 
  Соматотропин что такое
• 
  Питание по калориям меню 1200 калорий на каждый день
• 
  При беременности от кашля
• 
  Правильное питание для подростков
• 
  Поллиноз что это
• 
  Корь календарь прививок взрослым
• 
  Хронический риносинусит лечение
• 
  От расстройства кишечника таблетки