Трансферные белки в каких продуктах


В каких продуктах содержится растительный белок: подробный список

Для нормального питания организму необходимы жизненно важные элементы, среди которых находятся белки — животные и растительные. Это строительный материал клеток организма, участвующий в важнейших процессах жизнедеятельности. Длительное питание без употребления белков может привести к тяжелым заболеваниям.

Белки в пищевых продуктах — соединения, состоящие из последовательной цепочки различных аминокислот. Содержание растительных белков в разных продуктах различно.

Роль растительного белка в питании человека

Белки (протеины) — ценные составляющие питания, компенсировать которые невозможно ничем. Это сложные соединения, содержащие порядка 80 различных аминокислот. Большинство из них вырабатываются в организме самостоятельно, но 8 являются незаменимыми и поступают только с пищей.

Растительный белок:

  • обеспечивает организм витаминами, аминокислотами, микроэлементами;
  • улучшает обмен веществ;
  • укрепляет иммунитет;
  • нормализует процесс пищеварения;
  • способствует похудению;
  • оказывает положительное влияние на состояние кожи и волос.

Продукты с содержанием растительного белка

Основные источники, богатые растительным белком, — бобовые, зерновые, семена, орехи. Меньшее количество протеина содержат овощи и фрукты. В таблицах ниже приведены списки продуктов, содержащие растительные белки.

Количество белков и незаменимых аминокислот указано в граммах (на 100 г продукта).

Бобовые

Белок бобовых культур может заменить мясные белковые продукты, поэтому используется в питании вегетарианцами и желающими похудеть. Этим продуктам также уделяют внимание спортсмены с целью поддержания и наращивания мышечной массы.

При комбинировании разных видов бобовых можно обеспечить поступление в организм достаточного количества всех 8 незаменимых аминокислот.

Список основных продуктов:

НаименованиеБелкиЛейцинВалинТреонинИзолейцинЛизинМетионинТриптофан Фенилаланин
Арахис (все виды)25,801,671,080,880,910,930,320,251,34
Бобы (фасоль фава)26,11,961,160,931,051,670,211,10
Бобы мунг (маш)23,91,851,240,781,011,660,290,261,44
Горох колотый24,551,761,160,871,770,250,281,13
Соя (зерно, бобы)34,92,672,091,391,812,090,520,451,61
Спаржевая фасоль24,331,861,160,930,991,650,350,31,42
Тофу обычный8,080,610,410,130,40,530,10,130,39
Фасоль белая23,361,871,220,281,031,600,350,281,26
Чечевица25,81,280,231,121,80,220,231,27
Какао-порошок12,90,80,750,450,530,530,150,160,73
Бобы эдамаме12,350,880,550,490,540,740,150,56
Зеленый горошек5,420,320,240,20,20,320,080,040,20
Соевое молоко3,270,190,120,110,110,130,030,11

Орехи и семена

Ценность продуктов обусловлена высоким содержанием жиров — источника полиненасыщенных жирных кислот и белков, значительная часть которых представлена незаменимыми аминокислотами.

Орехи и семена имеют высокую калорийность. Продукты незаменимы при соблюдении растительной диеты.

Основные источники белка:

НазваниеБелкиВалинИзолейцинЛейцинЛизинМетионинТреонинТриптофанФенилаланин
Кокосовое молоко2,420,140,090,170,10,040,080,030,12

Кунжут

19,40,890,781,340,550,560,770,30,89
Макадамия7,910,360,310,60,020,020,370,070,67
Грецкий орех15,230,750,631,170,420,240,60,170,71
Кедровый орех, сушеный13,690,690,540,990,540,260,370,110,52
Кешью18,221,090,791,470,930,360,690,290,95
Миндаль18,60,940,671,280,470,480,480,130,99
Фисташки20,271,230,891,541,140,34 0,670,271,05
Фундук14,950,70,551,060,420,220,50,190,66
Семена абрикосов25,00,890,671,550,670,280,660,331,1
Семена горчицы25,81,090,881,761,270,491,10,341,01
Льняное семя18,291,070,91,240,860,370,770,30,96
Семена подсолнечника20,781,311,141,660,940,490,930,351,17
Семена чиа15,621,050,71,260,90,090,670,721,03
Тыквенные семечки30,231,581,282,421,240,61,00,581,73

Овощи и овощные продукты

Использование в питании овощей является полезной альтернативой продуктам животного происхождения. Культуры содержат необходимое количество важных элементов — витаминов, минералов, белков для поддержания здоровья и имеют минимум жиров.

Таблица основных продуктов:

НаименованиеБелкиЛизинВалинИзолейцинЛейцинМетионинТреонинТриптофанФенилаланин
Спаржа (аспарагус)2,20,1

0. 12

0,080,130,030,080,030,08
Баклажан1,010,050,050,050,060,010,040,010,04
Брокколи2,820,140,130,080,130,040,090,030,12
Брюссельская капуста3,380,150,160,130,150,030,120,040,1
Грибы белые свежие3,70,190,080,030,120,040,110,210,1
Корень имбиря свежий1,820,060,070,050,070,010,040,010,05
Капуста белокочанная1,80,060,050,060,060,050,010,06
Картофель2,00,140,120,090,130,030,10,030,10
Кольраби1,70,060,050,080,070,010,050,010,04
Картофельная мука (крахмал)6,90,410,360,30,430,110,280,120,32
Кукуруза белая, сладкая3,220,140,190,130,350,070,130,020,15
Лук репчатый1,40,060,030,040,050,010,040,020,04
Морковь0,930,10,070,080,10,020,190,010,06
Морские водоросли спирулина, сухие57,473,033,513,214,951,152,970,932,78
Огурец с кожицей0,650,030,020,020,030,010,020,010,02
Перец сладкий красный0,990,040,030,020,040,010,040,010,05
Петрушка2,970,180,170,120,20,040,120,050,15
Редис1,20,040,060,040,050,050,040,010,04
Салат1,50,10,080,050,070,040,070,010,07
Свекла сырая1,610,060,060,050,070,020,050,020,05
Помидоры1,10,040,020,030,040,010,030,010,03
Тыква1,00,050,040,030,050,010,030,010,03
Цветная капуста1,920,220,130,070,110,020,080,020,07
Чеснок6,360,270,290,220,310,080,160,070,18
Шпинат2,860,170,160,150,220,050,120,040,13
Щавель2,00,120,130,00,170,040,090,000,11

Фрукты и ягоды

Продукты этой группы не отличаются высоким содержанием белка. Их ценность состоит в высоком содержании витаминов и минеральных веществ, способствующих укреплению иммунной системы и общему оздоровлению организма.

Ягоды и фрукты помогают усвоению животных белков. Наибольшее количество растительного белка содержится в сушеных абрикосах, изюме, финиках.

Список продуктов:

Название БелкиВалинИзолейцинЛейцинЛизинМетионинТреонинТриптофанФенилаланин
Абрикосы1,40,050,040,080,10,010,050,020,05

Сухофрукты (курага)

3,390,080,060,110,080,020,070,020,06
Изюм без косточек3,070,080,060,10,080,020,080,050,07
Авокадо2,00,110,080,140,130,040,070,030,1
Ананас0,540,020,020,020,030,010,020,010,02
Апельсин0,940,040,030,020,050,020,020,010,03
Арбуз0,610,020,020,020,060,010,030,010,02
Бананы1,090,050,030,070,050,010,030,010,05
Виноград0,60,020,010,010,010,010,050,00,01
Груша0,40,030,030,020,030,010,030,010,03
Земляника садовая0,80,020,020,040,030,00,030,010,02
Киви1,140,060,050,070,060,020,050,020,04
Клюква0,390,050,030,050,040,000,030,000,04
Мандарин0,810,020,020,030,030,00,020,00,02
Персик0,910,020,020,030,030,010,020,010,02
Слива0,70,020,010,020,020,010,010,010,01
Финики полусухие2,450,070,050,080,070,020,040,010,05
Черешня1,060,020,020,030,030,010,020,010,02
Черника0,740,030,020,040,010,010,020,00,03
Яблоки0,40,010,010,020,020,00,010,000,01
Сухофрукты из яблок0,930,040,040,060,060,010,030,010,03

Зерновые

Протеин — важная составляющая зерна злаковых культур и продуктов их переработки. Содержание белка, в зависимости от вида, может составлять в среднем 5–25%. Питательная ценность продуктов зависит от аминокислотного состава.

Перечень продуктов:

НаименованиеБелкиВалинИзолейцинЛейцинЛизинМетионинТреонинТриптофанФенилаланин
Амарант13,560,680,580,880,750,230,560,180,54
Булгур12,290,550,460,830,340,190,350,190,58
Гречка13,250,680,50,830,670,170,510,190,52
Крупа перловая9,300,370,330,490,30,120,210,10,46
Пшено шлифованное11,50,470,431,530,290,30,40,180,58
Крупа ячневая10,00,480,470,510,350,160,250,120,52
Крупа кукурузная8,30,410,411,10,210,130,20,060,36
Крупа манная10,30,490,450,810,260,160,320,110,54
Кус-кус12,760,540,490,870,250,20,340,160,62
Макароны из цельной пшеницы14,630,640,571,00,320,240,390,190,73
Овес16,890,940,691,280,70,310,570,230,9
Овсяные отруби17,30,960,671,370,760,340,50,340,91
Просо11,20,580,471,40,210,220,350,120,58
Рис белый длиннозернистый7,130,440,310,590,260,170,260,080,38

Специи и растения

Используют для придания пище определенного вкуса и аромата, для лечения некоторых заболеваний. Специи и растения содержат полезные вещества и микроэлементы.

Основные продукты:

Название БелкиВалинИзолейцинЛейцинЛизинМетионинТреонинТриптофанФенилаланин
Базилик3,150,130,10,190,110,040,10,040,13
Мята перечная3,750,190,150,280,160,050,150,060,19
Корица3,990,220,150,250,240,080,140,050,15
Мак17,991,090,821,320,950,50,690,180,76
Мята3,290,160,140,250,140,050,140,050,17
Орегано9,00,590,440,780,50,130,320,20,45
Перец чили13,460,540,390,630,360,130,270,070,37
Перец черный10,390,550,371,010,240,10,240,060,45
Семена пажитника23,01,11,241,761,680,340,90,391,09
Чабрец9,110,50,470,430,210,250,19
Укроп3,460,150,20,160,250,010,070,010,07

Перенос и окрашивание белков вестерн-блоттингом

Визуализация белков в гелях

Визуализация белков на этом этапе полезна для определения того, мигрировали ли белки равномерно и равномерно. Используйте краситель для меди, если вы планируете переносить разделенные белки на мембрану, поскольку окрашивание кумасси необратимо. Используйте краситель Кумасси на гелях после переноса только для проверки эффективности переноса, или если вы не планируете переносить и просто хотите наблюдать результаты разделения SDS-PAGE.

Краситель Кумасси

Как только выключить питание, разделенные белковые полосы начнут диффундировать (они легко растворяются в водном растворе). Чтобы предотвратить диффузию белков, обработайте гель 40% дистиллированной водой, 10% уксусной кислотой и 50% раствором метанола, в результате чего почти все белки осаждаются (становятся нерастворимыми).

Для визуализации фиксированных белков поместите гель в ту же смесь воды / уксусной кислоты / метанола, но с добавлением 0.25% по весу кумасси бриллиантовый синий R-250. Инкубируйте от 4 ч до ночи при комнатной температуре на шейкере. Перенесите гель (сохраните смесь красителей; его можно использовать многократно) в смесь 67,5% дистиллированной воды, 7,5% уксусной кислоты и 25% метанола, поместите на шейкер и замените свежей смесью для полоскания до избытка. краситель был удален.

Пятно не связывается с акриламидом и вымывается (остается прозрачный гель). Однако он остается прочно связанным с белками в геле, и они приобретают темно-синий цвет.

Медное пятно

Кратковременно промойте свежееэлектрофорезированные гели в дистиллированной воде (максимум 30 секунд), а затем перенесите в раствор 0,3 М CuCl 2 на 5–15 минут. Немного промойте гели в деионизированной воде и рассмотрите их на фоне темного поля. Белки появляются в виде прозрачных зон на полупрозрачном синем фоне. Гели можно полностью удалить путем повторной промывки в 0,1–0,25 М Трис / 0,25 М ЭДТА, pH 8,0. Переместите гель в чашку с буфером для переноса, прежде чем продолжить перенос в соответствии с инструкциями производителя устройства для переноса.



Transfer

Подробные инструкции по процессу переноса можно найти на веб-сайтах производителей переносных устройств, и они будут различаться в зависимости от системы. Однако принцип во всех случаях один и тот же. Подобно тому, как белки с электрическим зарядом (обеспечиваемым связанным с ними SDS) могут проходить через гель в электрическом поле, так и белки могут переноситься в электрическом поле из геля на прочную основу, мембрану, которая «промокает» белки от геля.Ранние методы основывались на диффузии; блоттинг в электрическом поле теперь является стандартом.

Перенос может производиться мокрой или полусухой системой. Мокрый перенос менее подвержен сбоям из-за высыхания мембраны и особенно рекомендуется для больших белков. Для обоих видов переноса мембрану помещают рядом с гелем. Они зажаты между абсорбирующими материалами, а сэндвич зажат между твердыми опорами, чтобы поддерживать плотный контакт между гелем и мембраной.

При влажном переносе гель и мембрана зажаты между губкой и бумагой (губка> бумага> гель> мембрана> бумага> губка), и все они плотно прижимаются друг к другу, чтобы гарантировать отсутствие пузырьков воздуха между гелем и мембраной.Сэндвич погружают в буфер для переноса, к которому прикладывается электрическое поле. Отрицательно заряженные белки перемещаются к положительно заряженному электроду, но связываются мембраной, не позволяя им продолжать движение.

Стандартный буфер для влажного переноса такой же, как 1x Трис-глициновый буфер, используемый в качестве буфера для прогрева геля, но без SDS и с добавлением метанола до конечной концентрации 20%. Для белков крупнее 100 кДа рекомендуется включать SDS в конечной концентрации 0.1%.

При полусухом переносе сэндвич, состоящий из бумаги> геля> мембраны> бумаги, смоченной в буфере для переноса, помещается непосредственно между положительным и отрицательным электродами (катодом и анодом соответственно). Что касается влажного переноса, важно, чтобы мембрана находилась ближе всего к положительному электроду, а гель - к отрицательному.

Доля Триса и глицина в буфере для переноса не обязательно такая же, как при влажном переносе; обратитесь к протоколу производителя устройства.Стандартный рецепт: 48 мМ Трис, 39 мМ глицин, 0,04% SDS, 20% метанол.

Доступны два типа мембран: нитроцеллюлоза и ПВДФ (положительно заряженный нейлон). Выбор остается личным, и оба работают очень хорошо. Мембраны из ПВДФ требуют тщательной предварительной обработки: отрежьте мембрану до нужного размера, затем погрузите ее в метанол на 1-2 минуты. Инкубируйте мембрану в ледяном буфере для переноса в течение 5 мин. Неспособность уравновесить мембрану в ледяном буфере для переноса вызовет усадку при переносе и искаженную картину переноса.

Перенос больших и малых белков

Баланс SDS и метанола в буфере для переноса, размер белка и процент геля могут влиять на эффективность переноса. Следующие модификации будут способствовать эффективному переносу:

Крупные белки (> 100 кДа)

  • Для крупных белков перенос из геля может быть очень медленным, так же как они медленно перемещаются в геле во время разделения. При блоттинге большого количества белка обязательно анализируйте образцы в геле с низкой концентрацией, 8% или меньше.Они будут очень хрупкими, поэтому обращайтесь с ними осторожно.
  • Крупные белки имеют тенденцию осаждаться в геле, затрудняя перенос. Добавление SDS до конечной концентрации 0,1% в буфере для переноса будет препятствовать этому. Метанол имеет тенденцию удалять SDS из белков, поэтому снижение процентного содержания метанола до 10% или менее также защитит от осаждения.
  • Снижение процентного содержания метанола в буфере для переноса также способствует набуханию геля, что облегчает перенос крупных белков.
  • Метанол необходим только при использовании нитроцеллюлозы. При использовании ПВДФ метанол можно полностью удалить из буфера для переноса, и он необходим только для активации ПВДФ перед сборкой сэндвича из геля / мембраны.
  • Выберите влажный перенос в течение ночи при 4 ° C вместо полусухого переноса.

Маленькие белки (<100 кДа)

  • Все белки препятствуют связыванию с мембранами с помощью SDS, но малым белкам больше, чем большим. Если интересующий вас белок мал, исключите SDS из буфера для переноса.
  • Поддерживайте концентрацию метанола на уровне 20%.

Следующая ссылка обсуждает гель и буферную систему, которая позволяет переносить белки размером до 500 кДа:

Bolt MW and Mahoney PA (1997). Высокоэффективный блоттинг белков различного размера после электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Anal Biochem , 247, 185–92.

Другие наконечники для переноса:

  • Не прикасайтесь к мембране пальцами; вместо этого используйте пинцет.Масла и белки на пальцах будут препятствовать эффективному переносу и создавать грязные пятна.
  • После размещения геля и мембраны между бумагой пузырьки воздуха между гелем и мембраной можно удалить, раскатав их валиком, пипеткой или пробиркой на 15 мл, или собрав сэндвич в чашку с буфером для переноса, чтобы предотвратить образование пузыри в первую очередь.
  • Убедитесь, что бумага и мембрана обрезаны до того же размера, что и гель. Большие выступы могут препятствовать прохождению тока через мембрану при полусухом переносе.
  • Куриные антитела имеют тенденцию связывать PVDF и другие мембраны на основе нейлона, что приводит к высокому фону. Переход на нитроцеллюлозную мембрану должен помочь уменьшить фоновое окрашивание.


Визуализация белков в мембране с помощью Ponceau Red

Для проверки успешности переноса промойте мембрану в TBST. Развести бульон Ponceau Red 1: 100. Ложа состоит из 2% Ponceau S в 30% трихлоруксусной кислоте и 30% сульфосалициловой кислоте.

Инкубируйте на мешалке в течение 5 минут, затем тщательно промойте водой до тех пор, пока вода не станет прозрачной и полосы белка не станут четко очерченными.Мембрану можно полностью удалить путем многократной промывки в TBST или воде. При использовании мембраны из ПВДФ повторно активируйте мембрану метанолом, затем снова промойте в TBST.

TBS 10x

Для 1 л;
24,23 г Trizma HCl
80,06 г NaCl
Растворить в 800 мл дистиллированной воды
pH до 7,6 с HCl
Долить до 1 л

TBST

Для 1 л;
100 мл TBS 10x
900 мл дистиллированной воды
1 мл Твин 20

Твин 20 очень вязкий и прилипает к кончику мерных пипеток.Убедитесь, что вы добавили нужное количество моющего средства в буфер Трис. Дозировать 10% раствор легче, чем неразбавленный Твин 20.



Блокирование мембраны

Блокирование мембраны предотвращает неспецифическое фоновое связывание первичных и / или вторичных антител с мембраной (которая обладает высокой способностью связываться. белки и, следовательно, антитела).

Традиционно используются два блокирующих раствора: обезжиренное молоко или BSA (фракция V по Кону). Молоко дешевле, но не рекомендуется для изучения фосфобелков; Молоко содержит казеин, который является фосфопротеином, вызывая высокий фон, поскольку фосфоспецифические антитела обнаруживают казеин, присутствующий в молоке.

Некоторые антитела по неизвестным причинам дают более сильный сигнал на мембранах, заблокированных БСА, в отличие от молока. Проверьте примечания по применению в техническом описании, если есть конкретные инструкции о том, как заблокировать мембрану.

Чтобы приготовить 5% раствор молока или BSA, взвесьте 5 г на 100 мл TBS с буфером Tween 20 (TBST). Хорошо перемешайте и профильтруйте. Отсутствие фильтрации может привести к появлению пятен, где крошечные темные зерна будут загрязнять пятно во время проявления.

Инкубируйте 1 час при 4 ° C при перемешивании.После инкубации промыть в течение 5 с в TBST.



Инкубация с первичным антителом

Буфер для инкубации

Разведите антитело в TBST в предложенном разведении. Если в таблице данных нет рекомендованного разбавления, попробуйте диапазон разбавлений (1: 100–1: 3000) и оптимизируйте разбавление в соответствии с результатами. Слишком большое количество антител приведет к образованию неспецифических полос.

В некоторых лабораториях традиционно инкубируют в блокирующем буфере, в то время как другие лаборатории инкубируют антитела в TBST без блокирующего агента.Результаты варьируются от антитела к антителу, и вы можете обнаружить, что имеет значение либо использование неблокирующего агента в буфере антитела, либо тот же агент, что и блокирующий буфер.

Если высокий фон не является проблемой, некоторые антитела производят гораздо более сильный сигнал, если их разводить в буфере с низкими концентрациями (0,5–0,25%) молока или BSA, или вообще без них.

Время инкубации

Время может варьироваться от нескольких часов до ночи (редко более 18 часов) и зависит от аффинности связывания антитела с белком и количества белка.Мы рекомендуем более разбавленные антитела и более длительное время инкубации, чтобы гарантировать специфическое связывание.

Температура инкубации

Предпочтительно холодная. При инкубации в блокирующем буфере в течение ночи обязательно инкубируйте при 4 ° C, иначе произойдет загрязнение и, следовательно, разрушение белка (особенно фосфогрупп).

Рекомендуется перемешивание антитела для обеспечения адекватного гомогенного покрытия мембраны и предотвращения неравномерного связывания.



Инкубация с вторичным антителом

Промойте мембрану несколько раз в TBST при перемешивании, 5 минут или более на промывку, чтобы удалить остаточное первичное антитело.

Буфер для инкубации и разведение

Разведите антитело в TBST в предлагаемом разведении. Если в таблице данных нет рекомендованного разведения, попробуйте диапазон разведений (1: 1000–1: 2,0000) и оптимизируйте разведение в соответствии с результатами. Слишком большое количество антител приведет к образованию неспецифических полос. Вы можете инкубировать вторичное антитело в блокирующем буфере, но снижение фона может происходить за счет более слабого специфического сигнала, предположительно потому, что блокирующий протеин препятствует связыванию антитела с целевым протеином.

Время и температура инкубации

1-2 часа при комнатной температуре с перемешиванием.

Какой конъюгат?

Мы рекомендуем вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP). Вторичные антитела, конъюгированные с щелочной фосфатазой (ЩФ), менее чувствительны и не рекомендуются.



Методы проявления

Наборы для обнаружения

Для антител, конъюгированных с HRP, в качестве субстратов традиционно используются наборы с усиленной хемилюминесценцией (ECL).Мы предлагаем субстраты из HRP с различными пределами обнаружения.

Рентгеновские пленки

Автоматические проявители рентгеновских пленок широко используются и просты в использовании. Помните, что переэкспонированная пленка не подходит для анализа, так как невозможно определить относительное количество белка. На передержанных пленках видны полностью черные полосы без контраста и / или многочисленные неспецифические полосы.

Цифровые изображения

Новое поколение проявителей пленки - это устройства с камерой внутри корпуса, что устраняет необходимость в темной комнате.Камера обнаруживает хемилюминесценцию, исходящую от мембраны, преобразовывая сигнал в цифровое изображение для быстрого анализа с помощью программного обеспечения, поставляемого с детектором.

В настоящее время в продаже имеется ряд машин. В авангарде следующего поколения находятся системы, в которых не используются антитела, конъюгированные с HRP (например, хемилюминесценция). Например, анализаторы STORM обнаруживают флуоресценцию вторичных антител, конъюгированных с флуорохромом. Система инфракрасного изображения Odyssey обнаруживает инфракрасную флуоресценцию.

.

Анализ взаимодействия белков переноса меток | Thermo Fisher Scientific

Перенос меток включает методологию перекрестного связывания для изучения межбелковых взаимодействий путем маркировки белков, которые взаимодействуют с интересующим белком. Этот подход может быть использован для обнаружения новых взаимодействий, подтверждения предполагаемых взаимодействий, предложенных другими методами, и исследования интерфейса взаимодействующих белков.Кроме того, метод переноса метки способен обнаруживать слабые или временные белковые взаимодействия, которые часто ускользают от обнаружения в методах коиммунопреципитации и метода pull-down.


Методология переноса этикеток

В типичной реакции переноса метки белок-приманка реагирует с реактивным фрагментом реагента переноса метки (LTR), образуя ковалентную связь с гетеробифункциональным сшивающим агентом, связанным с радиоактивной, флуоресцентной или биотиновой меткой, как показано ниже.Затем этому меченому белку-приманке дают возможность взаимодействовать с белком жертвы in vitro с образованием комплекса, после чего реакцию подвергают воздействию ультрафиолетового света для активации фрагмента фотореактивной группы на сшивающем агенте, который затем ковалентно связывается с белком добычи. Перенос метки завершается расщеплением сшивающего спейсера для высвобождения белка-приманки, при этом метка остается прикрепленной к взаимодействующему белку жертвы, который может быть обнаружен несколькими методами, включая вестерн-блоттинг, анализ последовательности белка и масс-спектрометрию.Метка биотина особенно полезна в этом процессе, поскольку ее можно использовать как для очистки, так и для обнаружения белка жертвы.

Химия переноса этикеток. Sulfo-SBED содержит NHS-эфир, реагирующий с амином (левая сторона), арилазид, фотореактивная группа (в центре с атомами азота) и биотин (правая сторона). Передача биотина от амина на белке-приманке к целевой молекуле происходит за счет восстановления дисульфидной связи между NHS-эфиром и фотореактивной группой.


Label-transfer-diagram-692px

Общая схема реакции переноса этикетки.


Техническое руководство по сшивающим реагентам

Это 45-страничное руководство полезно как для новичков, так и для тех, кто имеет опыт работы с сшивающими реагентами.Он начинается с основного обсуждения сшивания и используемых реагентов. Руководство также содержит обсуждение различных приложений, для которых применялось перекрестное связывание, включая мощную технику переноса меток для идентификации или подтверждения взаимодействия белков. Химия сшивания рассматривается в удобном для понимания формате, предназначенном для передачи наиболее важной информации. Каждый сшивающий реагент Thermo Scientific Pierce показан вместе с его структурой, молекулярной массой, длиной спейсера и химической реакционной способностью.Справочник завершается списком отличных ссылок на использование сшивающих агентов и глоссарием общих терминов сшивания.

Техническое руководство по сшивающим реагентам

general-Crosslinking-Reagents-Handbook-450x600

Традиционные реагенты для переноса этикеток

Йодированные этикетки для авторадиографии

Самые ранние примеры реагентов для переноса метки включали фотореактивную фенилазидную группу, которая содержала гидроксифенильную модификацию на кольце.Фенольный гидроксил активирует кольцо, чтобы реакции замещения происходили в орто- или пара-положении относительно его положения. Эти соединения можно подвергать радиоактивному йодированию с использованием типичных окислительных реагентов, таких как хлорамин Т, или коммерческого реагента для йодирования. Йодирование сшивающего агента I-125 перед его использованием приводит к получению реагента для переноса радиоактивной метки, который может пометить неизвестный взаимодействующий белок радиоактивной меткой после отщепления спейсерного плеча сшивающего агента.

Йодированные шарики. Йодированные шарики Thermo Scientific Pierce с покрытием обеспечивают эффективное мечение йода и помогают предотвратить разрушительное окислительное воздействие, обычно связанное с хлорамином Т и другими методами на основе растворов.


Сшивающий агент сначала подвергается радиоактивному йодированию, а затем реагирует с белком-приманкой, обычно через доступные аминогруппы. Затем этот модифицированный белок добавляют к образцу и дают ему возможность взаимодействовать с другими белками, и образец подвергают воздействию УФ-света для фото-сшивания взаимодействующего комплекса.На этом этапе метка облегчает обнаружение взаимодействующих белков, или комплекс может быть расщеплен, а радиоактивная метка перенесена на белок, взаимодействующий с приманкой. Теперь радиоактивно меченый неизвестный белок затем выявляется авторадиографией после разделения с помощью электрофореза и вестерн-блоттинга.

Первые реагенты, использованные с использованием этого метода, были бифункциональными и были сконструированы так, что фотореактивный фрагмент несет переносимую метку. Эти молекулы реакционноспособны к амину или сульфгидрилу и радиоизотопно метят I-125.

Недостатки традиционных йодсодержащих реагентов

Хотя эти реагенты успешно использовались для получения данных о взаимодействии белков, они обладают некоторыми присущими им недостатками по сравнению с трехфункциональными реагентами, разработанными для приложений переноса меток.Пользователь должен знать следующие характеристики этих реагентов:

  • Реагенты требуют маркировки I-125 перед использованием, а эффективность включения этикеток низкая.
  • Стадия фотоактивации может привести к нескольким непродуктивным путям, которые снижают выход сшивки между приманкой и добычей.
  • Метка I-125 может высвобождаться во время световой реакции, вызывая неспецифическое мечение белка (ов) в смеси.
  • В некоторых молекулах отсутствуют соответствующие группы, которые можно йодировать, поэтому может потребоваться модификация первичных аминов с использованием реагента Болтона-Хантера.

Новые виды соединений были разработаны как трехфункциональные реагенты, которые более адекватно отделяют реактивные центры от метки. Все чаще эти новые виды реагентов включают нерадиоизотопные метки, такие как биотин.


Реагенты для переноса нерадиоактивных меток

Флуоресценция

Последующие разработки реагентов для бифункционального переноса меток используют нерадиоактивные метки, чтобы избежать проблем безопасности, связанных с I-125.Флуоресцентные компоненты, созданные в расщепляемых фотореактивных сшивающих агентах, обеспечивают метод переноса флуоресцентной метки на неизвестный взаимодействующий белок. При использовании этого подхода реагент не является флуоресцентным до воздействия УФ-света, но после фотолиза и связывания с взаимодействующими белками сшивающая молекула флуоресцирует.

Эти реагенты также имеют дисульфидную связь, которая может быть восстановлена, что приводит к расщеплению сшитых белков и передаче метки неизвестным взаимодействующим видам.Затем флуоресцентно меченый взаимодействующий белок можно проследить в клетках, чтобы определить место взаимодействия или судьбу белков после того, как взаимодействие произошло.

Поскольку флуоресцентные соединения по своей природе нестабильны при длительном воздействии света, это делает их менее чем идеальными в качестве реагентов для переноса меток. Для исследователей, желающих избежать радиоактивности, мы рекомендуем использовать реагент для переноса метки, который включает биотиновую метку, а не флуоресцентно меченый реагент.

Биотин

Реагенты для переноса меток могут также содержать биотин, встроенный в бифункциональную структуру сшивающей молекулы. После реакции с белками наживки и жертвы, как показано выше во вводной части, сшивающий агент расщепляется, в результате чего образуется меченый биотином белок жертвы, который можно использовать для обнаружения белка.

Этот тип метода трехфункционального переноса метки существенно отличается от ранее обсужденных бифункциональных методов из-за большого разнообразия методов, доступных для обнаружения белка жертвы. Поскольку белок биотинилирован, для обнаружения белка можно использовать как хромогенный, так и флуоресцентный подходы мечения с помощью авидин-, стрептавидин- или Thermo Scientific NeutrAvidin Protein, конъюгированной пероксидазой хрена (HRP), щелочной фосфатазой (AP) или флуоресцентной молекулой. Кроме того, ручка с биотином может использоваться для очистки белка или фрагментов белка жертвы с использованием агарозы, конъюгированной с авидин-, стрептавидином или нейтра-авидином, или хроматографии на магнитных шариках.

Существует множество определяющих структурных и функциональных свойств Sulfo-SBED, в том числе:

  • Аминно-реактивная группа NHS-сложного эфира - для мечения очищенного белка «приманки» на N-конце и боковой цепи остатков лизина
  • Арилазидная группа, активируемая УФ-светом - для неспецифического сшивания с боковыми цепями белка и основной цепью взаимодействующего белка после того, как произошло связывание белка
  • Расщепляемая дисульфидная связь (S-S) - может быть восстановлена ​​для высвобождения сшивающего агента из исходного белка-«приманки»
  • Группа биотина - остается прикрепленной к целевому взаимодействующему белку после разрыва дисульфидной связи, тем самым маркируя ранее неизвестный взаимодействующий белок (белки) для аффинной очистки и обнаружения

Структурные и функциональные свойства Sulfo-SBED для переноса биотиновой метки.


Поскольку биотин впервые был использован в приложениях для переноса меток, этот подход все чаще используется для обнаружения межбелковых взаимодействий, как указано ниже:

  • Определить взаимодействия комплексов с активаторными доменами
  • Уточнить механизм сборки белкового комплекса
  • Изучение места стыковки и факторные требования для привязки
  • Опишите связывающие контакты интеракторов
  • Подтвердить распознавание определенного фосфоэпитопа
  • Поиск предполагаемых партнеров по обязательству
  • Получение информации о взаимодействиях рефолдинга, опосредованных шаперонами
  • Изучить механизм взаимодействия белков
  • Облегчить аффинное мечение (повторное мечение), направленное на активность рецептора
  • Обнаружение рецепторов белков с низким содержанием
  • Понимание взаимодействия лекарственного средства с рецептором

Рекомендуемое чтение

  1. Neely KE et al.(2002) Взаимодействие активатора транскрипции с множеством субъединиц swi / snf. Mol Cell Biol 22: 1615–25.
  2. Ishmael FT et al. (2002) Сборка геликазы бактериофага t4: архитектура и стехиометрия комплекса gp41-gp59. J Biol Chem 277: 20555–62.
  3. Trotman LC et al. (2001) Импорт ДНК аденовируса включает рецептор комплекса ядерных пор can / nup214 и гистон h2. Nat Cell Biol 3: 1092–100.
  4. Horney MJ et al.(2001) Синтез и характеристика фотозондов инсулиноподобного фактора роста (igf) -1, селективных в отношении igf-связывающих белков (igfbps). Фотоаффинное маркирование igf-связывающего домена на igfbp-2. J Biol Chem 276: 2880–9.
  5. Daum JR et al. (2000) Контрольная точка веретена saccharomyces cerevisiae отвечает на отдельные микротрубочки-зависимые события. Curr Biol 10: 1375–8.
  6. Kleene R et al. (2000) Сайты связывания Sh4 zg29p опосредуют взаимодействие с амилазой и участвуют в конденсации-сортировке в экзокринной поджелудочной железе крысы. Биохимия 39: 9893–900.
  7. Minami Y et al. (2000) Критическая роль активатора протеасомы pa28 в hsp90-зависимом рефолдинге белка. J Biol Chem 275: 9055–61.
  8. Sharma KK et al. (2000) Синтез и характеристика пептида, идентифицированного как функциональный элемент в α-кристаллине. J Biol Chem 275: 3767–71.
  9. Ilver D et al. (1998) Helicobacter pylori, связывающий адгезин с фукозилированными антигенами гисто-группы крови, выявленный путем повторного добавления тегов. Наука 279: 373–7.
  10. Jacobson KA et al. (1995) Молекулярные зонды для мускариновых рецепторов: функционализированные конгенеры селективных мускариновых антагонистов. Life Sci 56: 823–30.
.

CETP - Предшественник белка-переносчика эфира холестерина - Homo sapiens (Человек)

CETP

Homo sapiens (Человек)

Оценка за аннотацию:

Оценка за аннотацию: 5 из 5

Оценка аннотации обеспечивает эвристический критерий содержания аннотации записи или протеома UniProtKB. Эту оценку нельзя использовать в качестве меры точности аннотации, поскольку мы не можем определить «правильную аннотацию» для любого данного белка.

Еще ...

- Экспериментальные данные на уровне белка и

Это указывает на тип доказательств, подтверждающих существование белка. Обратите внимание, что свидетельство «существования белка» не дает информации о точности или правильности отображаемых последовательностей.

Подробнее ...

Выберите раздел слева для просмотра содержимого.

.

PCTP - белок-переносчик фосфатидилхолина - Homo sapiens (человек)

PCTP

Homo sapiens (человек)

Оценка за аннотацию:

Оценка за аннотацию: 5 из 5

Оценка аннотации обеспечивает эвристический критерий содержания аннотации записи или протеома UniProtKB. Эту оценку нельзя использовать в качестве меры точности аннотации, поскольку мы не можем определить «правильную аннотацию» для любого данного белка.

Еще ...

- Экспериментальные данные на уровне белка и

Это указывает на тип доказательств, подтверждающих существование белка. Обратите внимание, что свидетельство «существования белка» не дает информации о точности или правильности отображаемых последовательностей.

Подробнее ...

Выберите раздел слева для просмотра содержимого.

.

Смотрите также