Содержание молочной кислоты в молочных продуктах

Streptococcus происходит от греческого «streptos» - легко скручивается, как цепочка, - и «kokkos» - зерно / семя, и этот термин впервые был использован Бильротом в 1874 году в качестве описания цепочечных кокковидных бактерий. .Розенбах (1884) впервые применил родовое название Streptococcus при описании S. pyogenes, цепочечного кокка, выделенного из гнойного абсцесса у человека. В 1906 году Эндрюс и Хордер исследовали 1200 стрептококков, выделенных из источников человека, воздуха и молока, и на основе метаболизма сахара, снижения нейтрального красного цвета и характеристик роста в молоке выделили восемь групп. Шерман в 1937 году произвел первую всеобъемлющую систематическую классификацию стрептококковых изолятов из экологических, комменсальных и больничных источников.Он исключил из рода Streptococcus все строго анаэробные кокки и пневмококки из-за их крайней чувствительности к желчи и ввел четыре основных подразделения: пиогенные, энтерококковые, молочнокислые и группы viridans [42]. Результаты молекулярных таксономических исследований позволили кардинально изменить классификацию Streptococcus spp .: «молочные» стрептококки теперь составляют род Lactococcus , а некоторые представители подразделения «энтерококки» Шермана стали членами-основателями рода Enterococcus . [43].Подразделение Streptococci на семь групп основано на данных о последовательности гена 16S рРНК, хорошо коррелирующих с результатами экспериментов по реассоциации ДНК-ДНК и численных таксономических исследований [44–46].

Единственный Streptococcus sp. полезен для ферментации молока (производство йогурта и вареных сыров швейцарского или итальянского типа, таких как Grana Padano, Gorgonzola, Mozzarella или Fontina) - S. thermophilus var. salivarius . Он имеет статус GRAS в США и квалифицированную презумпцию безопасности в Европейском союзе благодаря долгой истории безопасного использования в производстве пищевых продуктов.Конечными продуктами ферментации лактозы являются лактат, ацетальдегид и диацетил. Некоторые штаммы способны продуцировать термофилины, белковые соединения, которые ингибируют листерии и клостридии, особенно термофилин 13 и 1277 имеют широкий спектр ингибирования [15, 27, 28, 47–50].

Виды из рода Bifidobacterium были первоначально идентифицированы Тиссье в образцах стула грудных младенцев как бактерии странной и характерной формы Y в 1899 году и названы B.bifidus . В 1924 году Орла-Йенсен признал существование рода Bifidobacterium в качестве отдельного таксона, но из-за сходства бифидобактерий с родом Lactobacillus они были включены в этот род. В 1957 году Дехнарт осознал существование множества биотипов Bifidobacterium и предложил схему дифференциации этих бактерий на основе их пути ферментации гексозы [51].

Наиболее часто встречающиеся штаммы в желудочно-кишечном тракте человека включают B.adolescentis , B. bifidum , B. breve , B. catenulatum , B. pseudocatenulatum , B. longum subsp. infantis , B. longum subsp. longum , B . dentium и B. angulatum [52]. Бифидобактерии составляют до 25% фекальной микробиоты культивирования у взрослых и 80% у младенцев [53]. По словам Мацукианда и его сотрудников [54], наиболее часто выделяемые бифидобактерии из кишечного тракта взрослых - это B.catenulatum , B. longum и B. adolescentis, , тогда как в кишечнике младенца преобладают B. breve , B. infantis и B. longum .

Наиболее важными видами Bifidobacterium для применения пробиотиков являются B. longum , B. bifidum и B. animalis . Дети, получавшие смесь на основе молока с добавлением Bifidobacterium (штамм B. lactis Bb-12), были защищены от симптоматической ротавирусной инфекции.Ежедневное употребление трех чашек в день йогуртов B. longum уменьшило желудочно-кишечные расстройства, связанные с эритромицином. B. bifidum NCFB 1454 оказался активным против определенных видов Listeria , Bacillus , Enterococcus , Pediococcus и Leuconostoc из-за продукции бифидоцина B [15, 53, 28, 28 , 55, 56].

Количественное определение свободных жирных кислот в молочных продуктах

Животные жиры сложны и содержат короткоцепочечные жирные кислоты (SCFFA), которые являются водорастворимыми и очень летучими и не присутствуют в растительных жирах [3]. Растительный жир состоит в основном из нелетучих жирорастворимых жирных кислот. Основными жирными кислотами в молоке являются C _{16: 0} и C _{18: 1} , составляющие от ~ 22–35 до 20–30% от общих липидов, соответственно [3]. Жирные кислоты присутствуют либо в свободном состоянии, как свободные жирные кислоты (FFA), либо эстерифицированы как связанные жирные кислоты (FA) на глицеридах.Точное определение как FFA, так и FA может быть незаменимым для законодательных целей и контроля качества, а также для целей исследований и разработок. В этой главе основное внимание уделяется газохроматографическому обнаружению FFA. СЖК важны, так как они влияют на качество, вкус, текстуру, питание и здоровье продукта. На вкус многих молочных продуктов прямо или косвенно влияет профиль FFA продукта [2, 7]. Это особенно характерно для ферментированных молочных продуктов, поскольку FFA вносит прямой вклад в виде летучих ароматических компонентов или косвенно через летучих продуктов метаболизма, окисления или термической обработки (например,грамм. альдегиды, кетоны, спирты, лактоны и сложные эфиры). СЖК также могут влиять на текстуру и функциональность, поскольку они влияют на поверхностное натяжение и пенообразующую способность молока [8, 9], но также было показано, что некоторые СЖК, такие как конъюгированная линолевая кислота, оказывают благотворное влияние на здоровье и питание [6].

Методы экстракции жира должны учитывать различия в растворимости и летучести различных длин углеродных цепей ЖК, присутствующих в молочном жире. Следовательно, любой метод точного количественного определения FA должен быть эффективным при извлечении как водорастворимых SCFFA, так и органических растворимых FA, избегать использования стадий испарения для предотвращения потерь летучих SCFFA и удаления или нейтрализации любой воды, которая может присутствовать в пример.До сих пор наиболее распространенным подходом к количественному определению FFA в молочной промышленности и в исследованиях является газовая хроматография (ГХ) в сочетании с пламенно-ионизационным детектором (FID). ПИД используется потому, что он относительно дешев, прост / надежен, воспроизводим и широко доступен. В этой главе подробно обсуждаются преимущества и недостатки некоторых методов, используемых для извлечения и количественного определения FFA в молочных продуктах с помощью GC-FID.

2. Определение свободных жирных кислот в молочных продуктах

2.1. Экстракция липидов

Широко применяется экстракция жира из пробы растворителем.Однако, как упоминалось ранее, следует избегать стадий испарения, чтобы предотвратить потери летучих SCFFA. Были использованы такие растворители, как хлороформ [10], подкисленный диэтиловый эфир [11], гексан / диэтиловый эфир [12] и диэтиловый эфир / гептан [13]. Высокий уровень извлечения (> 92%) FFA был достигнут при использовании этих органических растворителей для сыра, но они гораздо менее надежны при применении в молоке из-за натурального масла в водной эмульсии молока и природы мембраны глобул молочного жира (MFGM). [14]. Кроме того, процедуры экстракции, в которых используются высокие температуры, такие как кипячение с обратным холодильником или дистилляция, также подвержены повышенному риску потери летучих SCFFA (ов).Во многих процедурах безводный сульфат натрия добавляется для поглощения присутствующей влаги в попытке предотвратить потери водорастворимого SCFFA в последующем процессе экстракции растворителем. При использовании смесей растворителей извлечение SCFFA может уменьшаться при увеличении неполярного компонента растворителя [11]. Растворители, способные экстрагировать весь диапазон FFA (ов), будут также извлекать оставшуюся липидную часть образца, и в зависимости от области применения может быть необходимо или целесообразно выделить компонент FFA перед анализом.Был использован ряд различных методов, таких как колонки кремниевая кислота / гидроксид калия (КОН) [10, 15, 16], ионообменные смолы [17-19], колонки с дезактивированным оксидом алюминия [12, 13] и колонки для твердофазной экстракции аминопропила. [13, 20].

Из-за сильнощелочной природы колонок с кремниевой кислотой / КОН или ионообменных смол может происходить гидролиз глицеридов [21, 22], что приводит к завышенной оценке содержания FFA. Ву и Линдсей [16] реализовали использование двух разных колонок: предварительную колонку для удаления молочной кислоты, за которой следует колонка кремниевая кислота-КОН для выделения FFA в сыре Чеддер, чтобы решить эту проблему.FFA (-ы) элюировали 2% -ной муравьиной кислотой в этиловом эфире. Needs et al. [17] описали другой метод выделения FFA из молока с использованием предварительно обработанной амберлитовой смолы. Липидный экстракт смешивали со смолой с последующим удалением растворителя и промывкой для выделения FFA. Deeth et al. [12] использовали колонки с дезактивированным оксидом алюминия для выделения FFA и сообщили о высоком извлечении C _{4: 0} –C _{18: 1} из молока, сыра и масла. Кислотная природа конечного экстракта (6% муравьиной кислоты в диизопропиловом эфире), как сообщается, оказывает пагубное влияние на производительность колонки, поскольку фаза колонки ухудшается, и это приводит к модификации процедуры с использованием более низкой концентрации муравьиной кислоты ( 3%) в диэтиловом эфире [13].Де Йонг и Бадингс [13], используя эталонную смесь, сравнили производительность аминопропиловых колонок и дезактивированного оксида алюминия при выделении FFA (ов) и сообщили о 96–101% извлечении аминопропиловых колонок против 82–89% выхода деактивированного оксида алюминия. Процедура была модификацией той, что использовалась Kaluzny et al. [20], которые получили 101,4% извлечения FFA, выделенных из липидов, с использованием твердофазной экстракции с аминопропиловыми колонками.

2.2. Деривитизация

Для анализа аналита с помощью ГХ он должен быть летучим.Для большинства липидов это не так, и для улетучивания жирных кислот широко используются методы химической дериватизации. Наиболее распространенный подход заключается в преобразовании ЖК в более летучую форму, такую ​​как метиловые эфиры жирных кислот, широко известные как FAME (ы). Таким образом, МЭЖК вводятся в колонку для ГХ в виде жидкости, улетучивающейся в газовую смесь при заданном потоке или давлении. Разделение происходит за счет различий во взаимодействии отдельного FAME с фазой колонки ГХ и использования градиента температуры в печи ГХ.Отделенный индивидуальный FAME переходит из столбца в FID, а затем определяется количественно. Подход FAME используется в текущем международном стандарте для анализа ЖК в молочном жире [23]. FFA (ы) можно превратить в FAME (ы) с использованием метанола в присутствии подходящего кислотного катализатора. Первая стадия - протонирование кислоты метанолом с образованием промежуточного продукта, который теряет протон с образованием FAME. Для доведения реакции до завершения требуется избыток метанола, поскольку это обратимая реакция.Также необходимо исключить воду из реакции, так как она является более сильным донором электронов, чем алифатические спирты, и будет ингибировать образование промежуточного соединения [24].

Было разработано несколько методов анализа FFA молочных продуктов, дериватизированных при комнатной температуре, без использования водных растворителей или стадий выпаривания. Кристоферсон и Гласс [25] описали использование 10% соляной кислоты (HCl) в метаноле в растворе молочного жира перед анализом методом ГХ. Luddy et al.[26] использовали трифторид бора (BF ₃ ) в метаноле для этерификации FFA в сливочном масле. Хотя эти методы полезны, определение FFA достигается путем получения производных FFA с глицеридами, что включает две разные стадии получения производных. Гидроксид тетраметиламмония (TMAH) давно используется в качестве этерификационного реагента для FA (s) [27]. Робб и Вестбрук [28] определили, что реакция ТМАГ протекает быстро при комнатной температуре, и что соли легко разлагаются в нагретом отверстии для ввода ГХ с образованием метиловых эфиров и триметиламина (ТМА).Полученные выходы составляли от 85 до 95%, и был сделан вывод, что эти переменные выходы делают метод пригодным только для качественных целей. Ограничением многих процедур метилирования является необходимость извлечения кислот из водного раствора перед этерификацией. Даунинг [29] исследовал получение солей тетраметиламмония в водном растворе с последующим анализом методом ГХ и обнаружил, что метод является количественным и воспроизводимым. Даунинг и Грин [30] использовали ТМАГ для этерификации полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) и обнаружили, что сильная щелочная природа раствора ТМАГ мешает процессу этерификации.Авторы преодолевают это, снижая pH (7,5–8,0) с помощью 5% раствора уксусной кислоты. Преимущество этого подхода состояло в том, что аммониевые соли FA (-ов) можно подвергнуть пиролизу с образованием чистых сложных эфиров внутри порта ввода ГХ, поскольку существующие методы в то время требовали омыления кислот перед добавлением этерифицирующих агентов. Эти методы описывают омыление смесей ЖК сильным основанием, таким как гидроксид натрия (NaOH) или КОН, с последующей этерификацией метанольной кислотой, такой как HCl, серной кислотой (H ₂ SO ₄ ) или BF ₃ до определить содержание FFA.Если связанная с глицеридом FA также требует определения, для образования метиловых эфиров можно использовать метанольное основание, такое как метоксид натрия (CH ₃ NaO). Поскольку гидроксиды четвертичного аммония по своей природе являются сильными основаниями, в метанольном растворе могут образовываться метиловые эфиры связанных глицеридом FA (-ов), а поскольку аммониевые соли FFA (-ов) разлагаются с образованием метиловых эфиров, TMAH считался более подходящим реагентом. в анализе FAME. Другие гидроксиды четвертичного аммония также использовали в анализе FAME.McCreary et al. [31] использовали гидроксид триметил (a, a, a-трифтор-м-толил) аммония в метаноле для определения содержания ЖК в растительных маслах, приготовленных в бензоле. Они сравнили этот подход с более распространенным CH ₃ NaO и достигли сопоставимых результатов. Они также были способны одновременно переэтерифицировать глицериды с образованием аммониевых солей FFA, которые при впрыске во вход ГХ этерифицировались за одну стадию приготовления. Опять же, это обеспечивало значительное преимущество по сравнению с существующими процедурами, которые требовали получения производных и анализа СЖК и глицеридов отдельно.Позже Меткалфф и Ван [32] также использовали ТМАГ в метаноле в одностадийном процессе для различных смесей липидов в диэтиловом эфире. Это приводило к различным фазам, в которых переэтерифицированные сложные метиловые эфиры глицеридов (FA) содержались в органической фазе, а соли аммония FFA (-ов) находились в водной фазе. Удобно, чтобы каждая фаза подходила для прямой инъекции в ГХ для определения характеристик FFA или глицеридов (FA). Позднее этот подход был применен для количественного определения FFA в молоке и сыре [33–36].Мартинес-Кастро и др. [33] также исследовали эффект нейтрализации реакционной смеси перед анализом, который обычно рекомендуется для ГХ-анализа для защиты колонки и любых ПНЖК, которые могут присутствовать. Они обнаружили, что нейтрализация основного раствора TMAH приводит к потере SCFFA (ов) и увеличению стандартных отклонений в аналитических данных. Они объяснили это диссоциацией солей аммония при выбранном pH (7,5–8,0). Преимущество ТМАГ состоит в том, что при пиролизе он разлагается до ТМА и метанола [31], которые являются очень летучими и поэтому подходят для анализа методом газовой хроматографии.Однако сообщалось, что ТМА мешает определению пиков [34]. Этот подход имеет очевидные преимущества в том, что как FFA, так и триглицеридные компоненты могут быть проанализированы из образца за одну экстракцию; однако ограничение процедуры с использованием реакции TMAH было подчеркнуто Martínez-Castro et al. [33]. Эти авторы отметили, что некоторое количество ЖК из органического глицеридного слоя было обнаружено в водном слое FFA, что привело к завышению оценки содержания FFA в сыре. Чтобы преодолеть это, авторы разделили каждый слой и промыли подходящим растворителем перед анализом.Чаварри и др. [36] определили, что при большом соотношении триглицеридов к FFA (что имеет место в большинстве молочных продуктов) проблема с диссоциацией FFA становится еще более выраженной. Авторы пришли к выводу, что необходимо выделить FFA из липидной смеси перед применением метода экстракции / этерификации TMAH, чтобы уменьшить эту ошибку.

2.3. Прямое добавление в колонку FFA

Выделение FFA на колонках с аминопропиловой твердофазной экстракцией (SPE) с последующим анализом GC-FID широко используется для количественного определения FFA [37–41], поскольку процесс выделения можно автоматизировать для степень и относительно прост в исполнении.В целом, это удобная альтернатива дериватизации и, как уже упоминалось, была разработана Калузным и др. [20] и впоследствии улучшенные [13, 37]. Этот подход работает без необходимости дериватизации, поскольку FFA летучие и, следовательно, могут испаряться в нагретом отверстии для впрыска. Используется холодный впрыск в колонку, за которым следует запрограммированное изменение температуры инжектора, так как это позволяет увеличить разделение FFA (-ов) на основе их летучести внутри инжектора. Существуют также коммерчески доступные колонки со специфическими фазами свободных жирных кислот (FFAP), которые обеспечивают полное разделение FFA (ов) с длиной цепи от C _{2: 0} до C _{22: 0.} Однако кислотные экстракты снижают производительность колонки, а высокое сродство FFA к фазе колонки может привести к необратимой адсорбции, образованию хвостов пиков, паразитным пикам или образованию двойных пиков [42, 43].

2.4. Сравнение методов прямого добавления FFA и TMAH FAME в колонку

Chavarri et al. [36] сравнили процедуру этерификации экстракции ТМАГ с хроматографической процедурой на колонке, описанной Де Йонгом и Бадингсом [13], где СЖК были выделены с использованием аминопропиловых колонок перед прямым вводом в ГХ-ПИД.Существенные расхождения между обоими методами были очевидны при анализе FFA в сыре Чеддер. Уровни FFA были намного выше при использовании метода прямого впрыска в колонку (4007 ppm), чем при использовании метода TMAH (1683 ppm). Обычно уровни FFA в сыре Чеддер ниже 2000 частей на миллион, таким образом, существует значительная ошибка при использовании метода прямого впрыска в колонку. Впоследствии было показано, что более высокие уровни FFA являются следствием диссоциации глицеридов в слое FFA. Это можно исправить, выделив FFA из липидной смеси перед применением экстракции / этерификации TMAH.Mannion et al. [44] также сравнили и подтвердили оба метода. Они использовали идентичную технику экстракции жира и выделения FFA для обоих методов, используя процедуру диэтиловый эфир / гептан, описанную Де Йонгом и Бадингсом [13]. Кроме того, при исследовании аналитической устойчивости оценивались точность, прецизионность, пределы обнаружения (LOD) и пределы количественной оценки (LOQ). Для оценки пригодности метода для количественного определения FFA в молочных продуктах, которые имеют различные матрицы образцов, липидный состав и концентрацию FFA, был проанализирован широкий спектр образцов молочных продуктов.Среди исследуемых продуктов были сыры (Чеддер, Бри и Блю Стилтон), сухое цельное молоко, детские смеси, молоко, йогурт, мороженое и сыры с модифицированными ферментами. Повторяемость выражалась в процентах (%) относительного стандартного отклонения (RSD). Извлечение оценивали путем добавления известного количества FFA в каждый образец с расчетами, основанными на извлечении FFA между образцами с добавлением и без него. Измеренные уровни FFA варьировались от 173 ppm в детской смеси до 126 615 ppm в сыре, модифицированном ферментами.Оба метода дали аналогичные результаты для каждого типа образцов, а повторяемость была превосходной (0,8–13,8% RSD), за исключением молока, мороженого и йогурта (до 46,2% RSD). Диэтиловый эфир / гептан использовался в качестве экстрагирующего растворителя для обоих методов и не подходит для надежной экстракции FFA, если MFGM остается неповрежденным. Это легко исправить, используя альтернативную экстракцию на основе этанола, как описано De Jong и Badings [13] или De Jong et al. [37]. Анализ FFA непосредственно в виде кислот с использованием метода прямого добавления в колонку привел к проблемам с деградацией колонки из-за кислотной природы экстракта FFA.Это привело к сдвигу пиков времени удерживания, расширению пиков и потере разрешения со временем. Также потребовались дополнительные шаги для предотвращения и контроля уноса из-за высокого сродства FFA к фазе колонки. Анализ FFA методом TMAH FAME также не прошел без проблем. Наиболее летучие SCFFA элюировались с пиком растворителя, который влиял на чувствительность, и образование артефактов периодически мешало количественному определению других SCFFA. В целом, прямой метод на колонке оказался наиболее чувствительным с уровнем детализации 0.7 частей на миллион и LOQ 3 частей на миллион и требовали меньшего количества пробоподготовки, так как FFA вводили непосредственно после выделения без необходимости дериватизации. Хотя метод TMAH FAME был менее чувствительным из двух методов (LOD 5 ppm; LOQ 20 ppm), он оказался гораздо более надежным методом, при котором целостность колонки не нарушалась во время анализа и времени удерживания, а пиковая хроматография оставалась стабильный. Кроме того, авторы описали автоматизированную процедуру дервитизации, которая была значительно быстрее и использовала меньшие объемы растворителя, чем традиционные процедуры.

2,5. Дальнейшие разработки в методах GC-FID

Использование спиртов с более высокой молекулярной массой можно рассматривать как альтернативу решению многих проблем, связанных с метиловыми эфирами, таких как совместное элюирование пиков растворителя с наиболее летучими FAME (ами) и образование артефактов. Исследования Parodi [45] продемонстрировали повышенное извлечение SCFFA (ов), когда бутиловую этерификацию проводили вместо метиловой этерификации. Parodi [45] оценил несколько различных методов метилирования, таких как использование BF ₃ в метаноле [46], CH ₃ NaO [47] и методы бутилирования с использованием H ₂ SO ₄ в бутаноле [48], ди- н-бутилкарбонат [49] и BF ₃ в бутаноле [45] для определения жирнокислотного состава масляного жира.Пароди [45] выразил данные как соотношение количеств каждого сложного эфира жирной кислоты по отношению к соответствующему сложному эфиру миристата и получил лучшее извлечение при использовании бутиловых эфиров по сравнению с методами метилирования BF ₃ в метаноле или CH ₃ NaO. Parodi [50] использовал КОН в бутаноле для образования бутиловых эфиров и представлял собой модификацию методов, описанных Christopherson и Glass [25], а также Kim Ha и Lindsay [51], где они использовали BF ₃ в бутаноле для количественного определения FFA в молоке. и сыр.Таким образом, использование бутиловых эфиров может быть более подходящей альтернативой метиловым эфирам при анализе FFA в молочных продуктах.

Большинство публикаций по определению FFA в молочных продуктах ссылаются на давно установленные методы экстракции. Похоже, что в последние годы мало или совсем не было разработок или подтверждений. Были предприняты некоторые усилия по улучшению и проверке существующих методов экстракции жира. Широко используемый метод экстракции Folch et al. [52] была модифицирована Фирлом и соавт.[53] для извлечения липидов из проб молока, которые впоследствии были преобразованы в метиловые эфиры с использованием гидроксида триметилсульфония (TMSH) и проанализированы с помощью GC-FID. Они подтвердили свой подход, добавив в образцы молока триглицериды, и сообщили о LOD, LOQ, точности и точности, что было особенно полезно. Однако количественное определение FFA в образцах молочных продуктов не проводилось. Reis et al. [54] описали новый метод с использованием термодесорбции для выделения ЖК из молока с использованием TMSH для преобразования триглицеридов в FAME (ы).Образцы реагента и молока просто смешивались во флаконе с автоматическим пробоотборником, и при инициировании работы прибора происходила реакция с подогревом (процесс, который они называли термохимолизом) с количественным определением FA с помощью масс-спектрометрии ГХ (МС). Они сравнили это с методом экстракции Роуза-Готлиба [55], где обычная переэтерификация с использованием КОН в метаноле дала сопоставимые результаты в отношении извлечения и воспроизводимости, за исключением C _{4: 0} . Эти авторы также сообщили об ограничениях при работе с сырым негомогенизированным молоком с плохой повторяемостью между анализами.Это было связано с тем, что объем молока, который использовался для анализа, не был репрезентативным для всей пробы молока. Оценка метода THM была основана на линейности, воспроизводимости в сравнении с обычным методом экстракции, определение FFA не было включено. Юрченко и др. [56] применили проверенный подход к определению ЖК в молозиве крупного рогатого скота. Они выполнили экстракцию и подготовку FAME (ов) в соответствии с процедурой AOAC [57], где к образцу добавляли метанольный раствор NaOH, а затем метанольный BF ₃ для образования FAME (ов).Затем их экстрагировали из образца путем разделения фаз с использованием гептана и насыщенного раствора хлорида натрия (NaCl). Сообщалось о линейности, точности, прецизионности, LOD и LOQ. Этот метод можно применять к молоку и другим образцам молочных продуктов; однако индивидуальное определение FFA (ов) не было включено, и были исследованы только FA с длиной углеродной цепи C _{8: 0} –C _{18: 0} .

Amer et al. [58] описали новый подход к количественному определению FFA в молоке с помощью GC-MS.Они использовали этилхлорформиат для образования этиловых эфиров в растворе с добавлением пиридина в качестве катализатора в хлороформе. Восстановление дейтерированных внутренних стандартов FA использовали для количественного определения каждой FFA. Авторы также подтвердили метод и сообщили о повторяемости, линейности, восстановлениях, LOD и LOQ. Этот метод применялся к различным образцам коровьего молока: сырого, жирного (3,55%), полуобезжиренного (1,5%) и обезжиренного (0,1%). Стабильность метода оказалась превосходной с RSD <4% для всех FFA и извлечением> 99%.Некоторые из проблем, связанных с летучестью и растворимостью в воде SCFFA (ов), связанных с метиловыми эфирами, преодолеваются за счет использования этиловых эфиров. Кроме того, устранение требования предварительной экстракции перед добавлением дериватизирующего агента дает определенные преимущества. Однако этот метод, по-видимому, ограничен только водными образцами, но представляется гораздо более подходящей альтернативой многим существующим методам.

3. Заключение

Несмотря на важность определения свободных жирных кислот в молочных продуктах для исследований, законодательства, разработки процессов и контроля качества, методик был разработан очень мало.Кроме того, было сообщено мало информации о валидации, аналитической надежности, линейности, точности, LOD и LOQ. Последние разработки по улучшению методов экстракции, валидация которых проводилась по

Молочные продукты

доктора А.Р. Холм

Кафедра пищевых наук

Университет Гвельфа, ON N1G 2W1

Электронная почта: Dr. A.R. Холм

Сыр изготавливается из молока коз, овец, буйволов, оленей, верблюдов, лам и яков, но обычно его делают из коровьего молока. Коровье молоко на 88% состоит из воды, а остальное - это жир, белок, сахар, минералы и витамины. В процессе сыроварения большая часть белков, жиров и некоторых минералов и витаминов концентрируется и разделяется в твердом виде.Оставшаяся жидкость, называемая «сывороткой», содержит большую часть сахара и воды, а также немного белка, минералов и витаминов. Сыворотка используется в пищевых продуктах и ​​кормах или утилизируется как отходы.

Есть два основных агента, которые вызывают концентрацию и разделение белков и жиров для производства сыра, а именно бактериальная культура и коагулирующий фермент.

Бактериальная культура

Бактерии часто вызывают порчу пищи, но есть также много полезных видов. При производстве сыра и других кисломолочных продуктов молочнокислые бактерии превращают молочный сахар в молочную кислоту.Кислота действует как консервант, подавляя нежелательные типы бактерий, помогает удалить воду из творога (образование творога описано в следующем разделе) и важна для развития текстуры сыра. Молочнокислые бактерии и другие микроорганизмы, которые случайно присутствуют в сыре, вносят вклад в ферменты, которые расщепляют жиры, белки и сахар во время выдержки, создавая аромат, характерный для определенных сортов сыра. Молочнокислые бактерии естественным образом присутствуют в молоке, а сыр можно приготовить, храня свежее молоко в теплой среде.Однако этот процесс идет медленно, и качество сыра, как правило, нестабильно. Рекомендуется пастеризовать молоко путем нагревания при 60–62 ° C (140–144 ° F) в течение 30 минут. Эта тепловая обработка уничтожит большинство молочнокислых бактерий в молоке, а также уничтожит патогенные бактерии, которые могут вызвать пищевые болезни. Обратите внимание, что чрезмерная пастеризация препятствует правильной коагуляции. Молоко, покупаемое в большинстве магазинов, не подходит для изготовления сыра, потому что оно подверглось слишком большой термической обработке.

После пастеризации молоко охлаждают до 32-37 ° C (89.6-98.6F) и молочнокислые бактерии добавляются в молоко. Суспензия бактерий называется «культурой», а процесс добавления культуры в молоко - «инокуляцией». Культура может быть замороженным или лиофилизированным концентратом бактериальных клеток или это может быть кисломолочное молоко (молоко, в котором молочнокислые бактерии могут расти). Для определенных видов сыра рекомендуются различные бактериальные культуры, но большинство из них можно приготовить с использованием свежего простого йогурта или пахты в качестве культуры.Если используется йогурт, молоко должно быть инокулировано при 37 ° C. Пахта содержит газообразующие бактерии и может вызвать появление маленьких глазков у некоторых сыров. В дополнение к бактериям, некоторые виды сыра, такие как «голубой» и «камамбер», заражены плесенью для придания характерного внешнего вида и аромата.

Коагулирующие ферменты

Белки можно рассматривать как длинные микроскопические цепи. Различные пищевые продукты, такие как желе, джемы и сыр, зависят от способности белковых цепей переплетаться и образовывать сетчатую сеть.Формирование этой сети называется «коагуляцией». Когда белки коагулируют в воде, они захватывают воду в сети и превращают жидкость в полутвердый гель. В сыроварении гелеобразование вызывается ферментом «сычужным ферментом». Когда сычужный фермент добавляется в теплое молоко, жидкое молоко превращается в мягкий гель. Когда гель станет достаточно твердым, его разрезают на небольшие кусочки, размером 0,5-1,0 см (1 / 4-3 / 8 дюйма), которые называются «творог».

Исключения

Некоторые виды сыра, например, Кесо Бланко (страны Латинской Америки) и Панир (Индия), производятся без бактериальных культур и без сычужного фермента.В этих типах творог образуется путем добавления уксуса (или других кислых соков) в горячее молоко. В этот буклет включена процедура осаждения Кесо Бланко, осажденного горячей кислотой, потому что это один из самых простых в приготовлении вариантов, и его преимущество состоит в том, что все молочные белки, включая белки, которые обычно теряются в сыворотке, включены в сыр. Некоторые свежие сыры (т. Е. Сыры, которые едят сразу после производства), такие как творог и творог, производятся с небольшим содержанием сычужного фермента или без него. В этих сырах коагуляция вызывается высоким содержанием кислоты в бактериальной культуре.Включена процедура на свежий сыр или творог по-европейски.

Принадлежности для сыроварения и обучение

Для производителя домашнего сыра стартовый набор принадлежностей должен включать: пастеризатор, форму для сыра, пресс для сыра, термометр для молочных продуктов или любой пищевой термометр для диапазона от 0 до 100 ° C и сырную ткань. Бактериальные культуры и сычужный фермент иногда можно купить в магазинах натуральных продуктов.

Небольшое оборудование для производства сыра и другие материалы, включая литературу, можно приобрести в компании New England Cheese Making Supply, 85 Main St., Ashfield, MA 01330 (413-628-3808; факс: 413-628-4061).

Принадлежности для сыроварения и однодневные курсы по изготовлению сыров можно заказать в Glengarry Cheesemaking and Dairy Supplies, RR # 2, Александрия, Онтарио, K0C 1A0 Телефон: (613) 525-3133, Факс: (613) 525-3394, glengarrycheesemaking. on.ca

Культуры, сычужный фермент, оборудование для производства сыра и другие материалы можно приобрести в Danlac, 466 Summerwood Place, Airdrie, Alberta, T4B 1W5, телефон 403-948-4644, факс 403-948-4643, www.danlac.com, электронная почта Egon Сковмосе

Лиофилизированные культуры и сычужный фермент в форме таблеток доступны в больших заказах от Chr.Hansens Laboratories Ltd., 1146 Aerowood Drive, Mississauga, L4N 1Y5, 905-625-8157, и от Rhodia Canada Inc., 2000 Argentia Road, Plaza 3, Suite 400, Mississauga, Ontario, L5N 1V9, телефон 905-821-4450 , Факс 905-821-9339. Позвоните и спросите о ближайших к вам розничных дистрибьюторах.

Некоторые ссылки

Альфа-Лаваль. Справочник по молочным продуктам . Альфа-Лаваль, Food Engineering AB. P.O. Box 65, S-221 00 Лунд, Швеция. [Хорошо иллюстрированный текст. Отличное введение в молочную технологию.

Американская ассоциация общественного здравоохранения, Стандартные методы исследования молочных продуктов . 1015 Eighteen St. NW, Вашингтон, округ Колумбия

Бергер В., Клостермейер Х., Меркених К. и Ульманн Г. 1989. Производство плавленых сыров , Руководство JOHA. Б.К. Ладенбург, Ладенбург.

Кэрролл Р. и Кэрролл Р. 1982. Производство сыра стало проще . Storey Communications Inc., Поннал, Вермонт. [Хорошо иллюстрированное руководство для небольших и домашних сыроварен]

Косиковский, Ф.В., Мистри В.В. 1997. Сыр и кисломолочные продукты , 3-е издание, F.V. Kosikowski and Associates, Бруктондейл, штат Нью-Йорк.

Закон, B. 1999. Технология сыроделия Sheffield Academic Press, Шеффилд, Великобритания.

Скотт Р., Робинсон Р.К. и Уилби Р.А. 1998. Сыроварня. 3-е издание. Прикладная наука. Publ. Ltd., Лондон.

Троллер, J.A. 1993. Санитария в пищевой промышленности . 2-е издание. Академическая пресса. Нью-Йорк.

Вальстра П., Геуртс Т.Дж., Нумен А., Джеллема А. и ван Бёкель М.А. 1999. Молочные технологии . Марсель Деккер Инк. Нью-Йорк, штат Нью-Йорк.

Сайты

Гвельфский университет пищевых наук: http://www.uoguelph.ca/foodscience/content/dairy-education-series

Центр исследований молочных продуктов, Мэдисон, Висконсин. www.cdr.wisc.edu/

Канадский информационный центр молочной промышленности, www.dairyinfo.gc.ca

CheeseNet, cheesenet.wgx.com/

ТВОРОЖ КИРПИЧНЫЙ СЫР

Кирпичный сыр - это полумягкий созревший сыр.Его текстура и вкус обусловлены действием бактерий, которые растут на поверхности сыра. Обычно его формируют в виде каравая.

Процедура

1. Пастеризовать цельное молоко путем нагревания при 62 ° C в течение 30 мин. Не допускайте чрезмерной пастеризации.
2. Охладите молоко до 30 ° C и добавьте 25 мл низкотемпературной закваски (иногда называемой мезофиллической закваской и 2 мл сычужного фермента на 10 кг молока. (Примечание: бактериальный мазок должен образовываться самопроизвольно во время созревания во влажном помещении (шаг 12)). , вы можете повысить вероятность успеха и однородность, добавив мазок с молочной культурой.Подходящие культуры доступны от многих поставщиков культур)
3. Когда молочный гель полностью расколется на ноже (примерно через 25 минут после добавления сычужного фермента), разрежьте гель на кубики 1/4 дюйма.
4. Осторожно перемешивайте 10 минут.
5. Приступите к приготовлению. Медленно поднимите температуру до 36 ° C. Это должно занять 20 минут.
6. Удалите большую часть сыворотки, но оставьте достаточно, чтобы покрыть творог.
7. Добавьте воду при 36 ° C, чтобы промыть творог. Добавьте половину веса молока и осторожно перемешивайте в течение 20 минут.
8. Слейте большую часть сыворотки, но оставьте достаточно, чтобы покрыть творог.
9. Залейте творог и оставшуюся воду для стирки в пяльцы.
10. Переворачивайте сыр через первые 30 минут, а затем каждый час в течение 4 часов (всего 5 поворотов).
11. Натрите солью всю поверхность сыра.
12. Храните сыр во влажном помещении (влажность 95%) при температуре 12-15 ° C для образования мазка (рост бактерий на поверхности) около 2 недель. Раз в два-три дня переворачивайте сыр и промывайте 4% рассолом.При отсутствии влажного помещения сыр можно класть в закрытую, но не закрываемую емкость. Интерьер должен оставаться влажным и иметь воздухообмен.
13. Сыр вымыть для удаления пятен, просушить и пропылесосить или покрыть парафином. Хранить при 5 ° C для дальнейшего созревания. Оптимальный вкус должен быть примерно через 4 недели созревания.

КОТТЕДЖНЫЙ СЫР В ЕВРОПЕЙСКОМ СТИЛЕ

Творог по-европейски имеет небольшой творог и часто сильно взбитый. Молоко коагулируется молочной культурой без сычужного фермента или других коагулирующих ферментов.

Процедура

1. Снимите как можно больше сливок из свежего молока.
2. Пастеризуйте обезжиренное молоко при 62 ° C в течение 30 минут и сливки при 70 ° C в течение 30 минут.
3. Охладите обезжиренное молоко до 32 ° C.
4. Добавьте низкотемпературную закваску из расчета 5%, т.е. 0,5 кг закваски на каждые 10 кг молока. Дайте молоку застыть на 4-6 часов, пока не образуется мягкий гель. При разрыве ножом или тупым предметом творог должен полностью разорваться, а разорванная часть заполниться прозрачной сывороткой.В качестве альтернативы можно использовать 1% культуры со временем схватывания 12-18 часов.
5. Осторожно перемешайте и медленно нагрейте до 52 ° C. Держите при этой температуре около 30 минут, пока творог не станет твердым.
6. Слейте большую часть сыворотки, замените ее холодной водой и осторожно перемешайте в течение 15 минут, чтобы из творога вымылся кислый привкус. Если вы предпочитаете кислый сыр, мойку можно не проводить.
7. Слейте оставшуюся сыворотку и промывную воду.
8. Добавить к творогу сливочную или кремовую заправку по вкусу.

Примечание : Может быть удобно сливать творог в тканевом мешке, в этом случае его можно промыть, замочив весь мешок в холодной воде на 15 минут.

NO-RENNET QUESO BLANCO (ЛАТИНО-АМЕРИКАНСКИЙ БЕЛЫЙ СЫР)

Кесо-бланко с термической кислотой или без сычужного фермента - это белый полутвердый сыр, изготовленный без культивирования или сычужного фермента. Его едят свежим и можно приправлять перцем, тмином, луком и т. Д. Он принадлежит к семейству «жареных сыров», которые не тают и могут быть обжарены во фритюре или приготовлены на гриле до золотисто-коричневого цвета для получения вкусной закуски.Жареный во фритюре Кесо Бланко можно замачивать в сахарном сиропе для десертного блюда или добавлять в суп в виде гренок. Приведенная здесь процедура аналогична изготовлению индийских панир и чанна, которые получают путем добавления кислоты в горячее молоко. Сыр рикотта также получают путем осаждения белков из смеси молока и сыворотки путем кислотного осаждения белков. Латиноамериканский белый сыр также производится путем сычужного помола цельного молока с небольшим количеством бактерий или без них. Сычужный кесо Бланко также можно использовать в качестве сыра для жарки, поскольку из-за отсутствия кислотности он имеет низкую плавкость.

Процедура

1. Нагрейте молоко до 80 ° C в течение 20 минут.
2. Добавьте уксус (5% уксусная кислота) из расчета около 175 мл на 5 кг молока. Уксус следует разбавить двумя равными объемами воды, а затем медленно добавлять в горячее молоко до тех пор, пока сыворотка не станет полупрозрачной, а частицы творога не начнут слипаться и станут слегка эластичными. Вы должны уметь растянуть кусок творога примерно на 1 см, прежде чем он сломается. Возможно, нет необходимости добавлять весь уксус.
3. Отделите творог, фильтруя через тканевый мешок, пока не будет удалена свободная сыворотка.
4. Добавьте соль (около 1%) и специи по вкусу.
5. Отжать творог (высокое давление не требуется).
6. Упакуйте творог в кипящие пакеты (если возможно, в вакуумную упаковку) и поместите в кипящую воду на 5 минут, чтобы стерилизовать поверхность и предотвратить рост плесени.
7. Queso Blanco может храниться в течение нескольких недель при правильной упаковке, но его следует есть как можно более свежим.

РЕЦЕПТ СЫРА РИКОТТА

1. Нагрейте свежую сыворотку до 85 ° C.Нагревание необходимо начинать сразу после удаления сыворотки из творога, чтобы предотвратить дальнейшее подкисление молочнокислыми бактериями. Сформируются небольшие частицы творога.
2. Медленно добавьте около 10 мл уксуса на литр сыворотки, осторожно помешивая. Вы увидите, что образуется больше частиц творога, а сыворотка станет менее «молочной».
3. Вылейте в ткань, чтобы отделить творог. После того, как творог высохнет, он готов к употреблению. Используйте его в лазаньи или ешьте как гарнир к основному блюду, или используйте его как творог в салатах.

Банкноты

Перед нагреванием сыворотки можно добавить до 10% цельного молока (то есть 100 мл молока на 1 литр сыворотки). Добавление молока поможет образовать более крупный творог, который легче отделить, и сыр будет иметь лучшую текстуру. Вы также должны добавить больше уксуса в зависимости от количества молока. Продолжайте добавлять уксус, пока сыворотка не станет совершенно прозрачной. Медленно добавляя уксус в течение примерно 5 минут, вы получите творог лучшего качества, и вам будет легче понять, когда следует остановиться.

Антимикробные характеристики молочнокислых бактерий, выделенных из ферментированных продуктов домашнего приготовления

Цель. Молочнокислые бактерии (LAB) были выделены из ферментированных продуктов, таких как клейкое рисовое тесто, кукурузная лапша, соус чили, маринованные огурцы из зелени и горчицы и вонючий тофу, на северо-востоке Китая. Штаммы LAB с антимикробной активностью были проверены, и семь из этих штаммов Lactobacillus были идентифицированы как L. plantarum , L. pentosus и L.paracasei с помощью анализа гена 16S рРНК. После обработки супернатанта LAB протеиназой K, пепсином и папаином их антибактериальный эффект практически исчез. Большинство штаммов с антибактериальной активностью обладали высокой устойчивостью к теплу (65–121 ° C), кислотности (pH 2–6) и алкоголю. Антимикробный эффект большинства штаммов, обработанных сурфактантом Твин-80, был значительно снижен, а антибактериальные свойства Т4 даже были потеряны. Результаты осаждения сульфатом аммония, ПЦР и наноЖХ-ESI-МС / МС подтвердили, что Т8 продуцирует антибактериальные вещества, принадлежащие к семейству белков, и его зона ингибирования против патогенов значительно увеличилась (> 13 мм).В экспериментах по подавлению роста бактерий количество колоний Staphylococcus aureus составляло до 10 ¹⁵ КОЕ / мл в группе 3de Man, Rogosa и Sharpe (MRS), и это значение было больше, чем в группе супернатанта 3S6. (10 ¹² КОЕ / мл) и контрольной группы (10 ¹⁰ КОЕ / мл) через 12 часов. Это исследование послужило основой для выбора антимикробных пептидов и разработки и использования LAB.

1. Введение

Болезни пищевого происхождения, связанные с потреблением свежей и минимально обработанной сельскохозяйственной продукции, вызвали серьезные вспышки и проблемы со здоровьем.Побочные эффекты от неправильного использования искусственных консервантов и антибиотиков стали серьезными. В пищевой промышленности традиционные методы стерилизации включают использование химических дезинфицирующих средств или стерилизацию высокотемпературным нагревом. Однако таким образом вредные бактерии уничтожаются не полностью, а органолептические качества снижаются [1]. Таким образом, текущие исследования направлены на продление срока хранения и антибактериальных свойств за счет использования антибактериального вещества из микроорганизмов через [2].

Lactobacillus широко используется в качестве пробиотиков в ферментированных пищевых продуктах.Анализ in vitro показал, что молочнокислые бактерии (LAB) обладают антиоксидантным действием и могут хелатировать ионы двухвалентного железа и разлагать нитриты и холестерин [3, 4]. ЛАБ являются естественными микробами, и их метаболиты обычно считаются безопасными [5]. Например, низин, который является противомикробным консервантом, является единственным разрешенным пищевым консервантом из lactococcus lactis для предотвращения роста конкретных патогенов и порчи, вызываемой организмами и бактериями. Продукты метаболизма LAB, такие как кислота, перекись водорода и бактериоцин, могут подавлять некоторые бактерии и грибки [6].Некоторые штаммы не обладают антимикробным действием, поскольку их метаболическая продукция недостаточна или минимальна [7]. Следовательно, следует проводить скрининг ЛАБ с высокой антибактериальной активностью и анализировать их антибактериальные компоненты.

LAB, выделенные из йогурта, прошли скрининг и функциональный анализ, и исследования показали, что их антибактериальные эффекты не очевидны. Однако следует исследовать LAB, выделенные из ферментированных продуктов домашнего приготовления. В этом эксперименте в качестве сырья были выбраны пять видов домашних ферментированных продуктов в Северо-Восточном Китае.Учитывая, что LAB обладают этими эффектами in vitro и что их метаболиты могут быть нацелены и играть роль в конкурентном исключении патогенов, мы должны проводить скрининг бактерий, которые продуцируют многочисленные антимикробные пептиды и кислоты, которые являются хорошими биоконсервантами для маринованных продуктов [8]. Таким образом, наше исследование было направлено на расширение скрининга LAB и получение новых и хороших штаммов.

2. Материалы и методы

2.1. Выделение и идентификация бактерий

Salmonella enterica (ATCC14028), Staphylococcus aureus (ATCC 6538p), Escherichia coli (ATCC 8739) и Bacillus cereus Frankland (CICC 20551) были использованы в эксперименте. Китайский центр коллекции промышленной культуры (CICC).

В общей сложности 231 штамм был случайным образом выделен из ферментированных пищевых продуктов, а именно, нианмианзи (клейкое рисовое тесто), танзимиан (кукурузная лапша), соус чили, маринованные огурцы с зеленью и горчицей и вонючий тофу, путем серийного разведения в агаре MRS (Qingdao Hopebio Co .) и двукратная очистка ЛАБ [9]. H, T, L и S - аббревиатуры, используемые для ферментированных продуктов, и количество изолятов, соответствующих названию штамма. Агар для подсчета планшетов использовали для мониторинга жизнеспособных бактерий на предмет резервной концентрации и хранили при -80 ° C в MRS с глицерином перед использованием.LAB были идентифицированы с использованием гена 16s рРНК с праймерами 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ') и 1492R (5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3') [10]. После этого секвенирование было выполнено в Basic Local Alignment Search Tool в базе данных EzTaxon-e с помощью программы сопоставления последовательностей.

2.2. Условия культивирования

Все выделенные штаммы инкубировали в бульоне MRS (37 ° C, 48 ч). Вторую культуру инкубировали (1%, об. / Об.) В течение 1 дня, и количество жизнеспособных клеток доводили до 10 ⁸ колониеобразующих единиц (КОЕ) / мл.Во всех экспериментах штаммы хранили при -20 ° C.

Salmonella , S. aureus , E. coli и Bacillus cereus Frankland выращивали в течение 24 часов и инкубировали в 1% инокуляции при 37 ° C со встряхиванием при 200 об / мин в бульоне CM0002 (CICC). . Вторую культуру инкубировали в течение ночи при 37 ° C и 200 об / мин.

2.3. Скрининг на антимикробную активность

Анализировали антимикробную активность супернатанта LAB. Все супернатанты осаждали центрифугированием при 4000 × g в течение 20 минут при 4 ° C, когда 1% инокулят инкубировали в течение 24, 48 и 72 часов при 37 ° C.pH был доведен до 6,0, чтобы исключить ингибирование кислоты. Все обработанные супернатанты хранили при 4 ° C. Затем было проведено тестирование всех индикаторных штаммов с использованием метода диффузии в оксфордской чашке (внутренний диаметр 6,0 мм). Метод распределения на чашках был подготовлен путем добавления инокулята-индикатора 100 мкл л 1,2 OD ₆₀₀ в чашку с агаром CM0002 [11, 12]. Ампициллин (25–100 μ г / мл, Beijing Solarbio Science & Technology) и низин (500 μ г / мл, растворенные в 0.05% уксусная кислота / 0,1 М ЭДТА, Shanghai Seebio Biotech, Inc.) использовали в качестве положительного контроля в планшете. Кроме того, 100 мкл л обработанного супернатанта наносили в чашку Oxford в планшете при 37 ° C в течение 24 часов.

2.4. Влияние ферментов на антимикробную активность

Ферменты добавляли к супернатанту отобранных штаммов, чтобы оценить их влияние на бактериоцин-подобные ингибирующие вещества. Супернатанты обрабатывали каталазой (5220 Ед / мг, Beijing Solarbio Science & Technology Co.) на водяной бане при 25 ° C в течение 1 ч, профильтровали и хранили при 4 ° C для последующих экспериментов. Добавляли буфер CaCl ₂ (0,05 моль / л Трис, 5 ммоль / л CaCl ₂ и pH 7,0) при концентрации ферментов 1 мг / мл, таких как протеиназа K (> 30 Ед / мг, Beijing Solarbio Science & Technology Co.), α -амилаза (100000 KSB, Aobox Biotechnology), лизоцим (20000 Ед / мг, Aobox Biotechnology) и папаин (400 Ед / мг, Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co.). Для другого эксперимента был приготовлен цитратный буферный раствор (pH 3) и пепсин 1 мг / мл (250 Ед / мг, Beijing Solarbio Science & Technology Co.) был выдан. Все растворы стерилизовали фильтрованием. Обработанные супернатанты устанавливали при 37 ° C на 3 часа, и смесь кипятили в течение 3 минут для инактивации ферментов. Бактериостатические эффекты анализировали с использованием метода диффузии Oxford Cup.

2,5. Антимикробная активность после обработки в различных условиях

Обработанные супернатанты отбирали и инкубировали в течение 48 часов. Было оценено влияние температуры на антимикробную активность супернатантов, нагретых до 65, 85, 100 и 121 ° C [13].Влияние pH определяли путем доведения pH супернатанта до 2, 3, 4, 5, 6, 8 и 14. Надосадочную жидкость выдерживали при 30 ° C в течение 1 часа. Наконец, pH был изменен до 6,0. n -Бутанол, метанол и этанол добавляли к супернатанту в соотношении 1: 9 (об. / Об.) И помещали при 30 ° C на 30 мин (органический растворитель от Beijing Chemical Works). После этого к супернатанту добавляли 1% (мас. / Т.) Цитрата натрия, хлорида калия и Твин-80 и перемешивали. Все обработанные растворы в антимикробных экспериментах инкубировали в течение 24 часов при 37 ° C с использованием метода диффузии Oxford Cup.Остаточную активность штаммов определяли по зоне их ингибирования. В качестве контроля использовали стерильную воду и необработанные образцы.

2,6. Осаждение концентрированных антибактериальных компонентов сульфатом аммония

(NH ₄ ) ₂ SO ₄ добавляли к 100 мл супернатанта культивированного штамма, достигающего 80% -ной концентрации (4 ° C, 24 ч) для дальнейшей очистки. чтобы оценить, принадлежат ли антимикробные компоненты LAB к семейству белков [14].Затем обработанные супернатанты центрифугировали, как и в предыдущих экспериментах. Затем супернатанты подвергали диализу, и антимикробную активность концентратов определяли с использованием метода Oxford Cup против S. aureus и Salmonella.

2.7. Ингибирование роста бактерий

Ингибирующие эффекты супернатантов определяли путем добавления их в индикаторный бульон S. aureus и Salmonella .После этого 1 и 3 мл супернатантов при pH 6,0 (48 ч) добавляли в концентрации примерно 10 ⁷ КОЕ / мл на начальной стадии к 100 мл бульона CM0002 для определения кривых роста индикаторов при 37 ° C и 200 ° C. об / мин. С интервалом в 2 часа бактериальные суспензии измеряли при оптической плотности 600 нм (OD ₆₀₀ ) до тех пор, пока они не инкубировались в течение 12 часов. Исходные MRS, низин-MRS (500 μ г / мл), ампициллин-MRS (100 μ г / мл) и канамицин-MRS (100 μ г / мл) получали, как описано выше, при 37 ° С в течение 48 ч в качестве контроля.Для определения общего количества колоний применяли метод подсчета плоских колоний при 37 ° C (12–24 ч).

2,8. Идентификация антимикробных пептидов

Целевой ген семи штаммов амплифицировали с использованием праймеров (прямой 5'-ATGAAAAAATTTCTAGTTTTGCGTGAC-3 'и обратный 5'-CTATCCGTGGATGAATCCTCGGACAGC-3') с помощью ПЦР. ПЦР выполняли в соответствии с протоколом реакции ExTaq (Takara) следующим образом: 95 ° C в течение 2 мин, затем 35 циклов при 95 ° C в течение 30 с, отжиг при 55 ° C в течение 45 с и удлинение при 72 ° C. на 30 с.Образец Т8 был дополнительно проанализирован с помощью наноЖХ-ESI-МС / МС (ProtTech, Сучжоу, Китай).

2.9. Анализ данных

Во всех экспериментах участвовали три случайно выбранных повтора для каждой обработки. SPSS использовался для анализа данных с помощью одностороннего дисперсионного анализа с уровнем значимости 0,5%.

3. Результаты и обсуждение

3.1. Оценка антимикробной активности

Предварительный эффект антимикробной активности штаммов определяли методом диффузии с 1 M HCl / NaOH для удаления кислоты, которая могла ингибировать продукцию патогенных бактерий в супернатанте.Тридцать пять штаммов проявили антимикробную активность против S. aureus (таблица 1). Одиннадцать штаммов также проявили сильный антибактериальный эффект с зоной ингибирования более 8,9 мкм. Зоны ингибирования S6, L2, T8 и H9 превышали 9,2 мм. Подобные условия наблюдались при ингибировании Lactobacillus Salmonella . Восемь штаммов покрывали зону ингибирования более 9 мм. По сравнению с контрольной группой и группой лечения против Bacillus cereus патогенные бактерии незначительно росли в середине зоны ингибирования в группе лечения.Некоторые споры могли расти в патогенном штамме B. cereus congenic, и LAB плохо подавлялись. Таким образом, B. cereus был исключен из дальнейшего исследования. Большинство штаммов не ингибировали E. coli , за исключением штаммов L2, L11, L19, T4, T8, T30, H9, h22 и S8 с зоной ингибирования 8 мм. Хотя большинство штаммов были ограничены против одного патогена в нашем исследовании, семь штаммов показали бактериостатический эффект широкого спектра. В целом подавляющее действие выделенных антибактериальных штаммов на S.aureus и Salmonella был больше, чем у E. coli и Bacillus . Результаты показали, что концентрация и тип продуцируемого антибактериального вещества отличались от LAB. Таким образом, разные LAB проявляли различную степень ингибирующей активности в отношении патогенных бактерий. Lanhua Yi [15] обнаружил, что Lactobacillus может быть усилен для избирательного подавления патогенных бактерий, и подтвердил, что L. coryniformis XN8 проявляет антимикробную активность широкого спектра и вызывает сильный антибактериальный эффект против S.aureus . Это открытие подтвердило характеристики избирательного ингибирования LAB [16].

Значение pH примерно использовалось для определения кислотности продуцированных Lactobacillus. Таблица 1 показывает, что количество кислоты (pH <3,7), секретируемой двумя штаммами, а именно T30 и S6, было выше, чем количество, продуцируемое другими штаммами.Это открытие указывает на различную регуляцию транспорта и метаболизм лактозной системы LAB и способность различных штаммов продуцировать кислоту. Таким образом, S6 имеет потенциал в качестве биоконсерванта и ферментационного агента при производстве ферментированных пищевых продуктов [17].

Семь штаммов, а именно L2, L16, L19, T4, T8, H9 и S6, а также индикаторные бактерии, а именно S. aureus и Salmonella , были исследованы для дальнейших соответствующих экспериментов.

3.2. Идентификация штамма

Семь изолятов с антимикробной активностью были идентифицированы с использованием гена 16s рРНК.Результаты сравнивались с данными в базе данных EzTaxon-e. В таблице 2 показаны три вида Lactobacillus , а именно L. plantarum (L2, L16, T4 и T8), L. pentosus (L19 и S6) и L. paracasei (H9). Штаммы достигли сходства более 99%.

6 100%3. Идентификация антимикробных компонентов Большинство штаммов утратили антимикробную активность после удаления кислоты. L19 незначительно снижал антибактериальный эффект ингибированных бактерий после введения каталазы. Это открытие позволило предположить, что основной антимикробный эффект некоторых штаммов зависит от кислоты, и подтвердил, что перекись водорода оказывает бактериостатический эффект [18]. В таблице 3 показан бактериостатический эффект семи штаммов после введения ферментной обработки.Эти супернатанты штаммов были частично инактивированы с использованием α -амилазы и лизоцима и, следовательно, индуцированы к снижению их антимикробной активности. Антимикробная активность штаммов, обработанных протеиназой К, пепсином и папаином, была полностью инактивирована, но антимикробная активность S6 немного сохранялась после введения папаина. Натараджан Деви [19] продемонстрировал, что бактериоцин, продуцируемый L. sakei GM3 из козьего молока, нестабилен после введения пепсина, трипсина, папаина и протеиназы Kare.Это открытие предполагает, что первичная антимикробная активность семи штаммов также зависела от пептидов после удаления кислоты и каталазы. Более того, результаты показали, что противомикробные вещества могут содержать углевод, который в определенной степени способствует ингибированию. Штамм Источник изоляции Идентифицированный % Сходство 100% L16 соус чили Lactobacillus plantarum 100% L19 соус чили 9018 Lactusobacillus pen.80% Lactobacillus paracasei 100% S6 вонючий тофу Lactobacillus pentosus 100% 9017 - Фермент Штаммы L2 L Протеиназа K - - - - - - - - - - Папаин - - - - - - + α173 + + + ++ ++ +++ +++ Лизоцим ++ ++ ++ + ++ ++ ++ ps: «-»: зона торможения <6 мм; «+»: Зона ингибирования: 6–8 мм; «++»: зона ингибирования: 8–9 мм; «+++»: зона ингибирования> 9 мм. 3.4. Влияние температуры, pH, добавок и органических соединений на противомикробные компоненты После того, как лечение проводилось при различных температурах, их влияние на антимикробную активность LAB было стабильным при низкой температуре в течение 30 минут (таблица 4). Аналогичным образом, бактериоцины, продуцируемые штаммами, выделенными из сальпико, термостабильны при 100 ° C в течение 20 мин [20]. Бактериоцины, продуцируемые L. bulgaricus, BB18 и L.lactis BCM5 были очень стабильны при высоких температурах, а их антимикробная активность сохранялась через 60 минут при 100 ° C. Однако антимикробная активность L16 и рост патогенов в зоне против индикаторных бактерий были в некоторой степени снижены при 121 ° C в течение 20 мин. Большинство антимикробных компонентов оставались стабильными при высоких температурах. Молекулярная масса антимикробных пептидов, которые представляют собой вторичные белковые структуры ( α -спираль, β -складывание, β -угол поворота и случайная извитость), составляет от 3 до 10 кДа.Их низкая молекулярная масса и вторичная структура могут привести к высокотемпературной устойчивости большинства антимикробных пептидов [21]. Это открытие показало, что антибактериальные компоненты LAB могут применяться в качестве биологических консервантов для высокотемпературной обработки пищевых продуктов. 9017 9017 +++ 3 9 0174 + Концентрация обработки Штаммы L2 L Температура / время 65 ° C / 30 мин + +++ +++ +++ +++ 85 ° C / 30 мин +++ +++ +++ ++ + +++ +++ +++ 100 ° C / 30 мин +++ +++ +++ +++ ++ + +++ +++ 121 ° C / 20 мин +++ + ++ ++ ++ +++ ++ pH 2 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ 4 +++ ++ + +++ +++ +++ +++ +++ 5 +++ +++ +++ ++ + +++ +++ +++ 8 ++ ++ ++ ++ +++ ++ 14 - - - - - - - Органический растворитель Метанол 10% (об. / Об.) ++ ++ + ++ ++ +++ ++ Этанол 10% (об. / Об.) +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ н-бутанол 10% (об. / Об.) +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ Присадка Хлорид калия 1% (вес / объем) +++ ++ +++ ++ ++ ++ +++ Цитрат натрия 1% (вес / объем) +++ ++ ++ ++ +++ +++ +++ Твин-80 1% (вес / объем) + + ++ - + + ++ пс: «-»: зона ингибирования <6 мм; «+»: Зона ингибирования: 6–8 мм; «++»: зона ингибирования: 8–9 мм; «+++»: зона ингибирования> 9 мм. Большинство штаммов подавлялись по двум показаниям, когда к супернатантам добавлялись три типа органических растворителей (таблица 4), и это наблюдение согласуется с данными Натараджана Деви [19], который продемонстрировал, что бацитрацин может быть растворим в органических растворителях. Однако антибактериальный эффект был в некоторой степени снижен при добавлении метанола к супернатантам T4 и L19, возможно, потому, что структура поверхности различных антимикробных агентов вызвала непереносимость метанола. Антимикробная активность супернатанта по отношению к индикатору была стабильной в широком диапазоне pH (2,0–6,0). Антимикробная активность LAB также сохранялась при pH 8 в течение 30 мин, но ингибирующий эффект S6 явно снижался. Антимикробная активность при pH 14 была полностью потеряна, и это открытие согласуется с Pediococcus pentosaceus бактериоцином ALP57, который теряет свою антимикробную активность при pH 12 [22]. В нашем исследовании высокая антимикробная активность была обнаружена при низком pH. Все супернатанты обрабатывали добавками, такими как цитрат натрия, калий и поверхностно-активные вещества, чтобы проверить влияние пищевых добавок и других химикатов на антибактериальные компоненты LAB (таблица 4). LAB продемонстрировал стабильную антимикробную активность в отношении индикаторных бактерий, обработанных цитратом натрия и калием. После добавления Твин-80 антимикробная активность заметно различалась, и Т4 утратил свою антимикробную активность. Priscilia Y [23] сообщила, что антимикробная активность Lactobacillus spp.изолированы из мексиканского сыра Кокидо против S. aureus , Listeria innocua , E. coli и S. typhimurium уменьшается при добавлении анионных соединений. Однако бактериостатическое действие бактериоцина CM3 стабильно при добавлении различных поверхностно-активных веществ. Такое поведение можно объяснить LAB из разных источников, продуцирующих бактериоциноподобные вещества (BLS), структура поверхности которых варьируется и, следовательно, приводит к разной чувствительности к Tween-80.В целом, различные поверхностные структуры BLS влияют на их антимикробную активность, и их устойчивость к веществам варьируется. штаммов L2, S6 и T8 были отобраны для дальнейших экспериментов на основе наших результатов. 3.5. Анализ антибактериальных компонентов после очистки В эксперименте концентрат, который ингибировал индикатор, был усилен после осаждения сульфатом аммония, показывая, что антимикробные компоненты этих штаммов были белками (рис. 1).Сравнение проводилось между зонами ингибирования необработанных и концентрированных образцов. Все зоны ингибирования концентрата против S. aureus были увеличены более чем на 12 мм (рисунки 1 (а), 1 (b) и 1 (с)). Зона ингибирования S6 достигла 15,22 ± 0,13 мм. Концентрации T8 и L2 заметно ингибировали Salmonella (Рисунок 1), а зона ингибирования T8 была более 13 мм. В целом, концентрат может усиливать противомикробную активность, и наблюдение было таким же, как и в предыдущих исследованиях, которые показали, что способность чистого плантарицина NC8 подавлять пищевые патогены явно выше, чем у необработанной группы [24].Осадок сульфата аммония, полученный из разных штаммов, проявлял различные ингибирующие эффекты против бактерий, что позволяет предположить, что LAB избирательно ингибируют патогены, а их антимикробные компоненты принадлежат к семейству белков [15]. S6 и T8 были выбраны для последующих экспериментов, поскольку концентрированный T8 значительно усиливал бактериостатический эффект двух патогенных бактерий, а S6 ингибировал S. aureus в большей степени, чем другие штаммы. 3.6. Влияние различных факторов на кривую роста индикаторных бактерий На рисунке 2 показано влияние различных факторов на рост патогенных бактерий. Lanhua Yi [15] сообщил, что LAB могут до некоторой степени подавлять рост бактерий. Антибиотик-MRS полностью подавлял гены нелекарственной устойчивости S. aureus . Однако OD , 600, и популяция показателя в группе MRS были выше, чем у экспериментальной группы с таким же объемом до 12 часов.Между тем, популяция S. aureus в 3 супернатанте (S6) варьировалась от 12 log 10 КОЕ / мл до 15 log 10 КОЕ / мл по сравнению с популяцией 3MRS, что было значительно выше, чем в группе 1. что выявлено по результатам подсчета колоний через 12 ч. Группа положительного контроля антибиотика-MRS также в некоторой степени способствует росту Salmonella [25, 26]. Этот результат согласуется с данными, описанными в недавней работе, которая показала устойчивость Salmonella к гентамицину, ципрофлоксацину, аминогликозидам и тетрациклину [27, 28] (Рисунки 2 (c) и 2 (d)).Этот феномен заметно изменил OD 600 и количество колоний Salmonella в группе антибиотик-MRS. В этом исследовании OD и количество сгустков показали, что супернатант или антибиотик могут уменьшить рост индикаторных бактерий по сравнению с контрольной группой с MRS. 3,7. Идентификация Bacteriocin ПЦР показала фрагмент ДНК размером 150–200 п.н. на рисунке 3 (L19, L16, L2, T4 и T8). Анализ последовательности показал, что целевой фрагмент ДНК достиг 100% сходства по сравнению с фрагментом PlnF в Национальном центре биотехнологической информации.nanoLC-ESI-MS / MS показала, что пептид имел молекулярную массу 5729,03 Да (таблица 5). По сравнению с UniProt, представленный пептид представлял собой пептид бактериоцина plnF, относительное содержание которого достигало 97,8%. Альберт [29] сообщил о присутствии генов, кодирующих плантарицин, таких как plnA, plnB, plnE / F и plnF, в LAB. 9 4. Выводы Исследования in vitro показали, что антибактериальные компоненты семи LAB, выделенных из нианмианци, танзимиана, соуса чили, маринованных огурцов из зелени и горчицы, и вонючего тофу были устойчивы к определенным диапазонам температур (65–121 ° C) , кислотность (pH 2–6), спирт и некоторые добавки.После предварительного обогащения сульфатом аммония бактериостатический эффект L. pentosus S6 против S. aureus составил 15,22 ± 0,13 мм, бактериостатический эффект L. plantarum T8 увеличился до 13,08 ± 0,15 мм. а зона ингибирования Т8 против Salmonella увеличилась до 13,37 ± 0,19 мм. Эти результаты продемонстрировали, что неочищенный экстракт Т8 проявлял хорошие антибактериальные эффекты широкого спектра. Результаты эксперимента по подавлению роста патогенных бактерий подтвердили, что LAB содержала определенную надосадочную жидкость, которая подавляла рост бактерий.Результаты nanoLC-ESI-MS / MS и ПЦР показали, что бактериоциновый пептид plnF существует в T8. Наши результаты послужили основой для проведения будущих исследований гетерогенной экспрессии антимикробных пептидов и скрининга других подходящих питательных сред на предмет роста LAB. Сокращения Масса белка Кол-во пептидов Заголовок последовательности Относительное количество Связь 5729.03 87 Бактериоциновый пептид PlnF OS = Lactobacillus plantarum (штамм ATCC BAA-793 / NCIMB 8826 / WCFS1) GN = plnF F9UU07 97,8% 99.0% мл: MRS: де Ман, Рогоза и Шарп BLS: Бактериоциноподобные вещества EDTA: Этилендиаминтетраацетатная кислота Колониеобразующая единица на миллилитр S.aureus: Staphylococcus aureus E. coli: Escherichia coli. Доступность данных Большинство данных об антимикробной активности показано в таблице 1; и в соответствии с частичными данными мы рисуем рисунок 2. Если вам понадобится вся база данных, свяжитесь с Dayong Ren. Конфликт интересов Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов при публикации данной статьи. Вклад авторов Дайонг Рен и Цзяньвэй Чжу внесли равный вклад в эту статью. Дайонг Рен, Цзяньвэй Чжу и Хансун Ю разработали и разработали эксперименты. Цзяньвэй Чжу и Шэнцзе Гун проводили эксперименты. Дайонг Рен, Цзяньвэй Чжу и Хунъян Лю проанализировали данные и написали рукопись. Благодарности Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (31401475) и Проектом фонда Департамента образования провинции Цзилинь [2015 (№196)]. . Смотрите также С какими программными продуктами приходилось работать В каком продукте больше всего кальция для костей Какие продукты нельзя есть людям с 3 группой крови В каких продуктах содержится много коллагена Какие продукты согревают организм В каких продуктах магний содержится Молочница у женщин какие продукты нельзя есть Какие продукты могут вызвать иерсиниоз В каких продуктах больше всего омега 3 Какие продукты повышают либидо женщин В каких продуктах содержится треонин Последние в категории Главные достопримечательности Азербайджана Главные достопримечательности Еревана Достопримечательности Армении